BIAŁKA

1. Gdzie występują białka :

• Stanowią około ¼ suchej masy ciała

• 20 % wagi ciała

• 1/3 mięśni

• 1/3 kości i tkanki chrzęstnej

• 1/10 skóry

• Pozostałe 1/3 tkanek i płynów ustrojowych

1. czy wszystkie enzymy są proteinami ??

• około 99,9 %

• wiele hormonów

• wszystkie wirusy

• wytwarzane przez rośliny i zwierzęta, każdy gatunek wytwarza swoje charakterystyczne białka

2. struktura aminokwasów :

3. struktura białek :

• I rzędowa

• II rzędowa

• III rzędowa

• IV rzędowa

2. Charakterystyka białek :

• Rodzaje aminokwasów w cząsteczce

• Powtórzenia aminokwasów

• Kolejność aminokwasów

• Struktura przestrzenna :

• Zwojowo-sznurkowa- silna i elastyczna

• Zbita, prętowa -nierozpuszczalna bardzo silna ; kości ścięgna , tkanka łączna

• Globularna kulista - proteiny krwi

• Ilości krzyżowych wiązań pomiędzy aminokwasami

3. Jakość białek :

• Białka pełne- zawierają wszystkie niezbędne aminokwasy NAA w odpowiedniej proporcji

• Białka niepełne (Niekomplementarne):

• Brak lub zupełny brak jednego lub kilku NAA

• Komplementarne

• Niekomplementarne + niekompletne = pełne

• O cechach uzupełniających się

4. zawartość białka w produktach roślinnych :

Ryż	9%
Strączkowe	20-40%
Ziemniaki	2%
Mąka pszenna	10%
Owoce	<1%

5. Podział białek :

• Albuminy

• Globuliny

• Prolaminy

• Gluteiny

Albuminy- mała masa cząsteczkowa , dobra rozpuszczalność w wodzie (α-laktoalbumina, albuminy surowicy.)

Globuliny- słabo lub brak rozpuszczalności w wodzie. Rozpuszczalne są solach 0,5 M NaCl (laktoglobulina, faseolina )

Prolaminy- duża zawartość kwasu glutaminowego i proliny , nierozpuszczalne w wodzie i soli, rozpuszczalne w 50-90% etanolu i gliadynie .

Gluteiny- duża zawartość kwasu glutaminowego, rozpuszczalne w 0,2% roztworze NaOH

6. Podział białek Cd.





7. Oznaczanie białek na podstawie zawartości azotu :

• Klejdahl

• Wbudowywanie barwinków

• Miareczkowanie formolowe

• Oznaczanie UV 260-280 nm. (TR, PH, TYR)

• IR amidy I i II

Analizowaną próbkę mineralizuje się w stężonym kwasie siarkowym z dodatkiem selenu jako katalizatora, nadtlenku wodoru jako utleniacza (jeśli jest konieczny) i siarczanu potasu służącego do podwyższenia temperatury wrzenia kwasu siarkowego. Po mineralizacji próbki, azot w niej zawarty występuje w postaci kwaśnego siarczanu amonu.

Ostudzony roztwór zadaje się roztworem mocnej zasady i oddestylowuje wydzielony amoniak do roztworu nasyconego kwasu borowego z dodatkiem wskaźnika mieszanego (czerwień metylowa + zieleń bromokrezolowa). Roztwór amoniaku w kwasie borowym oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem kwasu solnego (0,01 M do uzyskania barwy początkowej, takiej jak przed absorpcja amoniaku).

1. Mineralizacja :

Białko +


2.Destylacja :

alkalizacja i oddestylowanie amoniaku :




3.Miareczkowanie mianowanym roztworem kwasu solnego.

Mnożnik dla białka :

Mnożnik opiera się na przeciętnej zawartości azotu w białkach roślinnych i zwierzęcych (16%) 100/16=6,25

Białko	Zawartość N w białku	Mnożnik
Mleko	15,7	6,37
Mięso	16	6,25
Jęczmień Rzepak, fasola	16,7	6,00
Owies, groch	17,6	5,7
Bawełna, len	18,2	5,5

VIII. wyznaczanie mas cząsteczkowych :

• Średnia masa cząsteczkowa

• Ultrawirówka (sedymentacja)

• Chromatografia żelowa

Ultrawirowanie- oparte na sedymentacji , osadzanie cząstek rozpuszczonego polimeru w zależności od masy, kształtu, współczynnika sedymentacji . Pod wpływem pola odśrodkowego, przyśpieszenie osiągane w ultrawirówce 10- 100xg

Chromatografia Żelowa :

Sefadex- spolimeryzowany dekstran , polisacharyd otrzymywany czasie fermentacji z sacharozy przez Leuconostoc mesentereoides .

Sefadexy- hydrofilowe moczone w wodzie, lipofilowe LH-20 do wymywania polimerów organicznych. Rozdział uwarunkowany ograniczona dyfuzją cząsteczek do wnętrza żelu.

1. Wysoko sprawna chromatografia wykluczenia :

• Chromatografia wykluczenia ( ang. EC- exclusion chromatography ) określana tez jako chromatografia filtracyjna lub żelowa (ang. GPC- Gel permeation chromatography) jest specyficznym typem chromatografii .

• O rozdziale decyduje wielkości i kształt cząstek analizowanych składników .

• W kolumnie umieszcza się fazę stacjonarną o określonej wielkości porów. Małe cząsteczki mogą migrować do wnętrza porów i powrotem do przestrzeni pomiędzy ziarnami wypełnienia , gdzie przemieszcza się faza ruchoma. Natomiast cząsteczki o rozmiarach przewyższających wielkości porów posuwają się głównym strumieniem fazy ruchomej. W wyniku tego procesu następuje opóźnienie przesuwania się w kolumnie małych cząstek , tym większe im mniejsza jest cząsteczka. Ostanie kolumnę opuszczają cząsteczki o najmniejszej masie , są to zwykle cząsteczki fazy ruchomej . Można przyjąć że czas trwania rozdziału sprowadza się do czasu przepływu fazy ruchomej przez złoże kolumny.

Wypełnienia :

• Wypełnienia do chromatografii żelowej dzieli się na wypełnienia (żele) miękkie, półtwarde i twarde. :

• Żele twarde są oparte na materiałach nieorganicznych takich jak szkło, żele krzemionkowe, żele krzemionkowe modyfikowane.

• Żele półtwarde są produkowane z polistyrenu, octanu poliwinylu polimetakrylanu metylu.

• Żele miękkie są wytwarzane z częściowo sieciowanego polistyrenu , polidekstranu , poliakryloamidu.

9. Oznaczanie wartości odżywczej :

1. metoda chemiczna - analiza aminokwasów

2. metoda biologiczna

Metoda chemiczna :

• hydroliza kwasowa w 6M HCL w 24 h w temp. 120 C , niszczy: tryptofan, serynę, treoninę .

• hydroliza zasadowa: niszczy : argininę, cysteinę, cystynę, serynę i treoninę

Hydroliza enzymatyczna - nie wykorzystujemy w oznaczaniu zawartych aminokwasów w białkach no tracą łańcuch polipeptydowy w określonych miejscach . Próbkę po hydrolizie należy oczyścić i przeprowadzić oznaczenie.

Automatyczny analizator aminokwasów (AAA) :

Rozdział ( na zasadzie jonowymiennych ugrupowań , pH buforu dostosowane do pH aminokwasu ) prowadzony na kolumnach wypełnionych żywica jonowymienną - kationit z grupami sulfonowymi, wymiana jonowa między grupami kationitu
i aminokwasem
.

Wysoko sprawna chromatografia jonowymienna :

• w chromatografii jonowymiennej wykorzystuje się zjawisko wymiany jonów w centrach umieszczonych na powierzchni stałego nośnika .

• o rozdziale decydują oddziaływania międzycząsteczkowe jonów pochodzących z próbki z grupami jonowymiennymi a proces wymiany jonowej zależy od pH i mocy jonowej fazy ruchomej.

Wypełnienia :

• nowoczesne wypełnienia do chromatografii jonowymiennej , są otrzymywane przez chemiczne wiązanie związków zawierających grupy jonowymienne z powierzchnią inertnego nośnika. Materiały zawierające grupy jonowymienne zdolne do wymiany kationów nazywane są kationitami , natomiast zdolne do wymiany anionów anionitami.

• W zależność od właściwości wyróżnia się :

• Kationity silnie kwasowe , głównie na bazie silnie sulfonowej

• Kationity słabo kwasowe, np. z grupą karboksylową

• Anionity silnie zasadowe, głównie na bazie grupy czteroalkiloamoniowej.

• Anionity słabo zasadowe na bazie amin trzeciorzędowych

• Chromatografia na kolumnach jonowymiennych znajduje zastosowanie w oznaczaniu nonowych substancji organicznych i nieorganicznych

pH buforów :

• 3,0 -kwas asparaginowy, treonina, seryna

• 3,5- kwas glutaminowy, prolina glicyna, walina

• 4,25- metionina, izoleucyna, leucyna

• 5,28- lizyna, histydyna, arginina

Aminokwasy są wymywane odpowiednim zestawem. Stosowana jest ninhydryna - barwnik dający niebieskie zabarwienie z aminokwasami, prócz proliny która daje barwę żółtą. Reakcja zachodzi powoli, przyspiesza się ją podwyższając temperaturę. Mieszaninę umieszczamy na fotokolorymetrze, który ma dwa filtry . Następnie na rejestrator , gdzie rejestrowane są odpowiednie piki aminokwasów.

Ninhidryna:




XI. Detekcja pochodnych AA po kolumnie :

• Ninhidryna :

• Pierwszo i drugorzędowe AA

• Produkty- 570 nm. dla pierwszorzędowych

• 440 nm. dla drugorzędowych AA

• Czułość 10-tki pikomoli

• OPA aldehyd ortoftalowy :

• Pierwszorzędowe AA

• Drugorzędowe AA gdy próbka utleniona przed derywatyzacją

• Czułość 10pmoli

9. Metody analizy AA :

• Rozdział AA:

• Zazwyczaj wymagają derywatyzacji po kolumnie

• Jono-wymienna- silnie kationowo wymienne kolumny

• Jonowymienne- silne anionowo - dla detekcji elektrochemicznej bez upochodnienia.

• Parowania jonów -faza odwrócona HPLC

• Rozdział pochodnych AA :

• Różnorodność odczynników

• Wszystkie rozdziały techniką RPLC

9. Metody biologiczne :

Stosuje się wskaźnik aminokwasów ograniczających CS :




Zawartość aminokwasów egzogennych w :

a-badane białko

a_j-białku wzorcowym (białko jaja kurzego)

10. Badanie białek :

Metody oczyszczania białek :

• Techniki wirowania

• Wytrącania- różnice rozpuszczalności

• Chromatografia kolumnowa :

• Żelowa GPC

• Wiązania białek :

• Jonowymienna

• Powinowactwa

• HPLC

• Metody Elektroforetyczna

Właściwość funkcjonalne	Sposób działania	Przykłady produktów
Rozpuszczalność Absorpcja i wiązanie wody Lepkość Żelowanie Kohezyjność Adhezyjność Elastyczność Emulsyjność Absorpcja tłuszczu Wiązanie substancji smakowo zapachowych Pianotwórczość	Solwatacja Tworzenie wiązań wodorowych inkluzja wody Gęstnienie wiązanie wody Tworzenie matrycy koagulacja Spoiwo lepiszcze Tworzenie oddziaływań hydrofobowych , wiązań dwusiarczkowych Tworzenie emulsji stabilizacja emulsji tłuszczowych Wiązanie wolnego tłuszczu Adsorpcja, inkluzja , regeneracja Tworzenie błonki wokół pęcherzyków	Napoje Mięso, wędliny, chleb Zupy, sosy Mięso sery, galarety Wędliny ciasta Mięso pieczywo Wędliny, zupy, ciasta Mięso wędliny Analogi mięsa, pieczywo Kremy, desery, biszkopty, bezy

Białka są składnikiem żywność charakteryzującym się :

• Wysoką wartością odżywczą

• Stanowią źródło aminokwasów niezbędnych do wzrostu i prawidłowego funkcjonowania organizmu

• Są źródłem energii

• Oraz odgrywają rolę składników modelujących cechy funkcjonalne

Zapotrzebowanie na białko :

• Zapotrzebowanie na białko jest związane szczególnie w ostatnich latach z rozwojem nowych asortymentów żywności oraz z zapotrzebowaniem na żywność szybką i wygodną .

• Dodatek białka do żywność stwarza stwarza szerokie możliwość zmian nie tylko wartości żywieniowej ale głownie właściwości funkcjonalnych .

• Stad tez oznace w ostatnich latach zapotrzebowanie na preparaty białkowe, które ze względu na unikatowe właściwości zarówno technologiczne jak i żywieniowe.

Właściwości białek w żywności :

1. zdrowotne i żywieniowe :

• nieobecność czynników toksycznych

• niski poziom czynników antyodżywczych i innych substancji szkodliwych , oraz możliwość ich termicznej inaktywacji .

• duża zawartość białka

• czystość mikrobiologiczna

• wysoka biologiczna wartość odżywcza

2. Funkcjonalne :

• Korzystne właściwość fizykochemiczne w zakresie adsorpcji wody i tłuszczu

• Zdolność zatrzymania wody i tworzenia struktur

• Zdolność emulgowania tłuszczu

3. Sensoryczne :

• Neutralność w zakresie barwy, smaku, zapachu

• Zdolność do dobrego komponowania się podstawowymi surowcami w produkcie .

Właściwości funkcjonalne białek możemy podzielić na :

Organoleptyczne: barwa, smak zapach , tekstura

• Kinestetyczne: gładkość, zmętnienie

Właściwości wynikające z obecności wody:

• Rozpuszczalność, rozpraszalność, absorpcja wody, żelowanie, zdolność zatrzymywania wody, synereza, lepkość.

• Powierzchniowe: tworzenie emulsji, pienienie się , napowietrzanie, tworzenie błon , stabilizacja.

• Strukturalne : elastyczność, kohezja, gumowatość

• Teksturalne: lepkość, adhezja, tworzenie struktur

• Reologiczne : agregacja, żelowanie, tworzenie włókien elastycznych

• Inne: współdziałanie z dodatkami, enzymatyczne, właściwości modyfikujące.

Efekt pH :

• Ładunek jest determinowany głownie przez grupy kwasowe i zasadowe cząsteczki : (COOH, NH2) jonizacja tych grup zależy do pH

• Punkt izoelektryczny - białek pH przy którym cząsteczka nie ma ładunku.

• Powyżej PI- ma ładunek ujemny

• Poniżej PI ma ładunek dodatni

• Szybkość migracji proporcjonalna do ładunku i dlatego elektroforezę prowadzi się w roztworach

buforowanych.

Elektroforeza żelowa :

• Nośnikiem żelu płytka , lub w kształcie płytki

• Porowaty i chemiczne stabilny żel

Chromatograficzna natura żelu może być wykorzystana do wsparcia rozdziału np… wielkość porów -rozdział wg ciężarów cząsteczkowych

MEKC

• Micelarna elektrochemiczna chromatografia kapilarna- Micellar elektrokinetic chromatography (MEKC)

• Środek powierzchniowo czynny dodawany jest w nadmiarze do bufora, aż do wytworzenia miceli. Micele maja hydrofobowe jądro i zewnętrzny ładunek powodujący ruchliwość elektroforetyczną w zewnętrznym polu elektrycznym. Ruchliwość naładowanych miceli stanowi wypadkową ruchliwości elektroforetycznej i elektroosmotycznej.

• Rozdziela naładowane i obojętne związki.

• MEKC proces chromatograficzny lub pseudochromatograficzny -rozdział w oparciu o pseudsostacjonarną fazę.

Zastosowania :

• Białka i peptydy produkty mięsnych, mleczarskich i zbożowych

• AA i biogenne aminy

• Produkty reakcji Maillarda

• Witaminy

• Fenolowe przeciwutleniacze w herbatach i winie

• Dodatki do żywności ( barwniki, środki słodzące, konserwanty)

• Kwasy organiczne w napojach

• Pozostałości i zanieczyszczenia żywności

• Związki toksyczne

Co to jest elektroforeza ??

• Technika rozdziału oparta o ruch naładowanych cząstek

• Medium-płynie

• Pod wpływem pola elektrycznego

Elektroforeza- nazwa pochodzi połączenia słów elektro- i greckiego phoresis- przenoszenie, a podstawa technik elektroforetycznych jest fakt, ze cząstka obdarzona, ładunkiem i umieszczona w polu elektrycznym przemieszcza się .

• Do katody (elektrody ujemnej) wędrują cząstki obdarzone ładunkiem dodatnim i ten proces nosi nazwę kataforezy. Natomiast do anody (elektrody dodatniej) wędrują cząstki obdarzone ładunkiem ujemnym i ten proces nosi nazwę anaforezy .

Szybkość poruszania się cząstek w polu elektrycznym jest zróżnicowana i stanowi podstawę elektroforetycznego rozdzielenia mieszanin, przy czym prędkość ta jest wielkością charakterystyczną dla danej cząstki iż zależy od wielu czynników : które można podzielić na trzy zasadnicze grupy :

• Właściwości rozdzielanych cząstek

• Środowisko w którym cząstki wędrują podczas elektroforezy

Rozdział przeprowadza się w kapilarach ze stopionej krzemionki

(kwarcu) SiO2 wypełnionych roztworem elektrolitu nośnego .

Najczęściej stosowane są kapilary o średnicy wew. 25-75um i długości

około 50 cm Z zew. Stopiona krzemionka pokryta jest warstwą

poliamidową, celem zwiększenia jej wytrzymałości.

Elektroforeza kapilarna :

W elektroforezie kapilarnej decydujące znaczenie ma

jeszcze jedno zjawisko- elektroosmoza

gdy do końców kapilary wypełnionej roztworem elektrolitu

przyłożymy wysokie napięcie , obserwujemy przepływ

elektroosmotyczny , który polega na przemieszczaniu się. całej

masy elektrolitu w kierunku jednej z elektrod.

Przepływ osmotyczny Przepływ laminarny

Materiały żelowe :

• Agaroza :

• Polisacharydy otrzymane z agaru

• „prawdziwa elektroforeza” cząsteczki nie są absorbowane na nośniku

• Dużo zastosowań do badań enzymów i wirusów

• Poliakrylamid (PAGE) :

• Polimeryzacja akrylamidu w obecności N,N` -methylene- bis acrylamide

• Wielkość porów może być kontrolowana

• Mobilność cząstek obdarzonych ładunkiem zależy od :

• Mobilności elektroforetycznej

• Molekularne sita -pory nośnika

• SDS-PAGE

• Siarczan sodu dodecylu , surfaktant amoniowy (detergent)

• SDS wiąże się. z miejscami hydrofobowymi białek i wspiera rozdział poprzez :

• Zmniejszenie agregacji cząstek białka

• Wprowadzenie dużego ładunku - na białku- wpiera rozdział zgodnie

ciężarem cząstek - bardziej niż wielkością ładunku.

Próbka wprowadzana od strony anody

Podstawowe metody detekcji w CE

Metoda detekcji	Limit detekcji (mol/dm ^3)
Spektrofotometria absorpcyjna
S. fluorescencyjna
NMR
Elektrochemia
Konduktometria
Potencjometria
Amperometria
Radiometria

Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna :

• Odmianą CE pozwalającą na rozdział cząstek obojętnych. Stosowane są jonowe związki powierzchniowo czynne w stężeniu przekraczającym krytyczne stężenie micelarne (CMC) . do najczęściej stosowanych surfaktantów amoniowych należą SDS (
  )

Elektroforeza w nośnikach :

Wyeliminowanie zjawiska konwekcji cieczy, oraz znaczne ograniczenie dyfuzji., a także uproszczenie sposobu nanoszenia próbek. Zmniejszenie ich ilości i uproszczenie aparatury uzyskano dzięki wprowadzeniu podłoży będących nośnikami elektrolitu, podczas elektroforezy . nośnikiem może być odpowiednio uformowana, porowata masa, nasączona cieczą przewodzącą prąd. Cząstki obdarzone ładunkiem migrują w cieczy wypełniającej pory nośnika. O szybkości ich migracji decydują w tym przypadku nie tylko ładunek , ale często także rozmiary cząstek.

Białka

Fibrylarne -białka strukturalne nierozpuszczalne w wodzie i soli. Oporne na działanie alkaliów i kwasów

• Kolagen

• Elastyna

• Kreatyna

Złożone :

• Fosfoproteidy- gr. kwasu fosforowego.

• Chromoproteidy -gr. hemowa, hemoglobina, mioglobina

• Lipoproteidy- połączenia lipidami transport tłuszczu.

• Glikoproteiny - kompleksy węglowodanowe z białkiem.

---