ĆWICZENIE 5

Kataliza enzymatyczna - czynniki wpływające na aktywność enzymów

Wprowadzenie

Biochemiczne reakcje oksydoredukcyjne są podstawowymi procesami dostarczającymi energii niezbędnej dla przemian w organizmach żywych. Przyjmując za kryterium mechanizm działania, enzymy klasy oksydoreduktaz można ująć w cztery grupy:

1. dehydrogenazy - katalizują odrywanie atomów wodoru i przenoszą je na inne enzymy czy też związki pośrednie, a nie mają zdolności przenoszenia, elektronów bezpośrednio na tlen;

2. oksydazy - katalizują przenoszenie elektronów bezpośrednio na tlen. W pewnych przypadkach niektóre enzymy są zarówno oksydazami jak i dehydrogenazami tzn. odrywane od substratu elektrony przenoszą bezpośrednio na tlen bez udziału enzymów pośrednich;

3. oksygenazy - katalizują wbudowywanie tlenu w cząsteczkę;

4. hydroperoksydazy - obejmują dwie podgrupy enzymów: peroksydazy i katalazy. Obydwie podgrupy powodują rozkład nadtlenku wodoru. Peroksydaza rozkłada H₂O₂, a powstający tlen utlenia jakąś substancję, natomiast katalaza powoduje rozkład nadtlenku wodoru niezależnie od obecności akceptora tlenu.

1. Oksydazy

Enzymy te przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratem są często mono- i polifenole. Spośród oksydaz duże znaczenie praktyczne ma oksydoreduktaza, zwana potocznie oksydazą fenolową. Enzym ten jest metaloproteidem zawierającym w swoim składzie miedź (ok. 0,2%), która przyjmuje elektrony od fenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. Oksydaza fenolowa odgrywa dużą rolę w przemyśle spożywczym. Dzięki jej działaniu następuje ciemnienie przekroju rozciętego jabłka lub ziemniaka, efektem jej działania jest także kolor czarnej herbaty, chleba razowego.

Wykonanie doświadczenia

Przygotować wyciąg ziemniaczany przez umycie i obranie ziemniaka, utarcie na tarce i włożenie do woreczka płóciennego, a następnie, zanurzenie w zlewce z ok. 200 ml wody. Zawartość zlewki łagodnie mieszać. Uzyskuje się wodny ekstrakt enzymów i skrobi. Poczekać aż osad skrobi opadnie, ciecz nadosadową należy zdekantować i używać do doświadczeń.

Do 3 probówek wlać po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu, do drugiej 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, do trzeciej 10 kropli 1 % roztworu pirogalolu. Zawartość probówek zamieszać i obserwować zmiany zabarwienia. Ponieważ reakcja przebiega dość wolno, w międzyczasie należy wykonać pozostałe doświadczenia

Wyniki doświadczeń

W określonych odstępach czasu notować nasilenie barwy w probówkach zawierających poszczególne fenole.

Intensywność barwy Probówka	Czas
		0,5 godz.	1 godz.	1,5 godz.	2 godz.
z fenolem z pirokatechiną z pirogalolem

2. Katalaza

Katalaza jest nadzwyczaj szeroko rozpowszechnionym enzymem: występuje u zwierząt, roślin i wszystkich bakterii tlenowych. Katalizuje reakcję rozkładu nadtlenku wodoru do tlenu i wody według równania:

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂

Katalaza jest metaloproteidem i w stanie krystalicznym zawiera 0,09% żelaza. Istnieje wiele inhibitorów katalazy. Sam nadtlenek wodoru w większych stężeniach powoduje dezaktywację enzymu. Hamująco działa również szereg substancji reagujących z żelazem trójwartościowym, koenzymu katalazy (cyjanki, siarczki, fluorki, hydroksyloamina).

Wykonanie doświadczenia

Przygotować dwie probówki z 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej z nich dodać 1 ml 3% H₂O₂. Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu.

Drugą ogrzać do wrzenia w płomieniu palnika, po czym dodać 1 ml wody utlenionej. Zapisać w tabeli obserwacje.

Wyniki doświadczeń

Doświadczenie	Wynik	Wniosek
probówka 1 probówka 2

3. Peroksydaza

Peroksydaza jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach, występuje także u zwierząt i niektórych bakterii. Jej działanie podobnie jak katalazy związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Jednak nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, ale wykorzystywany jest przez enzym w reakcjach utleniania wielu substratów - fenoli i amin aromatycznych.

Podobnie jak katalaza, koenzym peroksydazy zawiera żelazo. Jest mało wrażliwa na wysoką temperaturę i jeszcze w 100°C zachowuje częściowo swoją aktywność. Przebieg typowej reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco:

peroksydaza

AH₂ + H₂O₂ ——→ A + 2 H₂O

Wykonanie doświadczenia

Do 3 probówek zawierających po 5 ml wyciągu ziemniaczanego wprowadzić do każdej probówki inną substancję po 10 kropli 1% roztworu fenolu, 1% roztworu pirokatechiny, 1% roztworu pirogalolu oraz do każdej probówki po 10 kropli 3% H₂O₂. Obserwować powstawanie barwy.

Do dwóch probówek odmierzyć po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Ogrzewać probówki w łaźni wodnej w temperaturze 70°C przez 10 min. Łaźnię wodną przygotować w sposób następujący: do zlewki nalać gorącej wody. Za pomocą termometru rtęciowego ustalić temperaturę wody nie wyższą niż 70°C, wstawić probówki z wyciągiem ziemniaczanym na 10 min. Po tym czasie do jednej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, a do drugiej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny i 10 kropli 3% H₂O₂. Zanotować rezultaty eksperymentu.

Wyniki doświadczeń

Doświadczenie	Wynik	Wniosek
Próba z fenolami probówka 1 probówka 2 probówka 3
Wpływ temperatury probówka 1 probówka 2

Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej

Odczynniki:

0,1 mol/l bufor fosforanowy 7,0

1% roztwór skrobi

0,01% roztwór jodu w 0,02% KJ

0,9% NaCl

Wykonanie:

1. Wykonanie roztworu amylazy ślinowej: 0,5 ml roztworu śliny rozcieńczyć w 100 ml 0,9% roztworu NaCl (dobrze wymieszać!)

2. - Przygotować 4 probówki i oznaczyć je numerami od1-4. Do każdej z nich wprowadzić 2 ml buforu fosforanowego o pH 7,0 oraz 2 ml roztworu rozcieńczonej uprzednio amylazy ślinowej.

3. - Zawartość probówki 1 zagotować nad palnikiem, a następnie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min., po czym ochłodzić.

4. - Do każdej z czterech probówek dodać: 2 ml 1% roztworu skrobi oraz 2 krople 0,01% roztworu NaCl

5. - Probówki nr 1 i 2 pozostawić w temperaturze pokojowej.

6. - Probówkę nr 3 wstawić do zlewki z lodem

7. - Probówkę nr 4 umieścić w łaźni wodnej o temp. 37⁰C

8. - po 10 min. Porównać zabarwienie w probówkach (skrobia nie rozłożona barwi się z jodem na kolor niebieski).

Wyniki doświadczeń

Nr probówki	Temperatura	Wynik	Wniosek
1 2 3 4	Pokojowa Pokojowa Lód 37^0C

Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznych

Odczynniki:

0,1 mol /l bufory fosforanowe o pH 3,5,7,8,10

0,01% roztwór jodu w 0,02% KJ

1% roztwór skrobi

0,9% roztwór NaCl

roztwór amylazy ślinowej:0,5 ml roztworu śliny rozcieńczyć w 100 ml 0,9% roztworu NaCl (dobrze wymieszać!)

Wykonanie:

Przygotować 5 probówek i oznaczyć je kolejno numerami 1-5.

Do każdej z nich wprowadzić 2 ml buforu o pH=3,5,7,8,10 oraz 2 ml roztworu amylazy ślinowej

Do każdej dodać roztworu 2 ml 1% roztworu skrobi Wstawić probówki na 10 min do łaźni wodnej o temp. 37⁰C. Następnie ochłodzić i dodać 2 krople roztworu jodu w KJ. Porównać zabarwienie w probówkach

Wyniki doświadczeń

Nr probówki	pH	Wynik	Wniosek
1 2 3 4 5	3 5 7 8 10

Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej

Odczynniki:

0,1 mol /l bufor fosforanowy o pH 7

0,01% roztwór jodu w 0,02% KJ

1% roztwór skrobi

0,9% roztwór NaCl

roztwór amylazy ślinowej:0,5 ml roztworu śliny rozcieńczyć w 100 ml 0,9% roztworu NaCl (dobrze wymieszać!)

Wykonanie:

Przygotować 3 probówki, do każdej odmierzyć po 2 ml buforu fosforanowego pH=7 i 2 ml roztworu skrobi. Do probówki pierwszej dodać 2 ml roztworu amylazy ślinowej, do drugiej 2 ml dwukrotnie rozcieńczonego za pomocą 0,9% NaCl roztworu amylazy. Do trzeciej 2 ml roztworu amylazy rozcieńczonego pięciokrotnie za pomocą 0,9% NaCl. Wstawić probówki na 10 min do łaźni wodnej o temp. 37⁰C. Następnie ochłodzić i dodać 2 krople roztworu jodu w KJ. Porównać zabarwienie w probówkach.

Wyniki doświadczeń

Nr probówki	Stężenie roztw. amylazy	Wynik	Wniosek
1 2 3	1 1:2 1:5

Wpływ aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznej

Odczynniki:

0,1 mol /l bufor fosforanowy o pH 7

0,01% roztwór jodu w 0,02% KJ

0,9% roztwór NaCl

1% roztwór skrobi

1% NaF

1%CuSO₄

1% kwas askorbinowy

Wykonanie:

Przygotować 5 probówek i oznaczyć je kolejno od1-5. Do każdej z nich wprowadzić po 2 ml buforu fosforanowego fosforanowego pH=7 i 2 ml roztworu amylazy ślinowej. Następnie dodać do probówek 5 kropli odpowiednich substancji:

Probówka 1 - 0,9% NaCl

Probówka 2 - 1% NaF

Probówka 3 - 1% kwas askorbinowy

Probówka 4 - 1% CuSO₄

Probówka 5 - woda destylowana

Po 10 min do wszystkich probówek dodać po 2 ml roztworu skrobi. Po następnych 10 min. Dodać 2 krople jodu w KJ i porównać zabarwienie.

Wyniki doświadczeń

Nr probówki	Substancja	Wynik	Wniosek
1 2 3 4 5	0,9% NaCl 1% NaF 1% kw. askorbinowy 1% CuSO4 woda destylowana