Wprowadzenie do genetyki drożdży Saccharomyces cerevisiae. Cykl życiowy drożdży. Test komplementacji.

Część teoretyczna:

Cechy drożdży jako organizmu modelowego:

Drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae, które są powszechnie wykorzystywane w przemyśle spożywczym, piwowarskim, farmaceutycznym, rolnictwie, znalazły również zastosowanie w biologii molekularnej, umożliwiając zrozumienie i wyjaśnienie wielu procesów zachodzących w komórkach wyższych eukariontów.

• drożdże są organizmami jednokomórkowymi, ale pod względem złożoności budowy ich komórki nie różnią się od komórek wyższych organizmów, stąd wyniki uzyskane u drożdży są również prawdziwe dla wyższych organizmów, w tym dla człowieka; wiele genów drożdżowych koduje białka, które wykazują nie tylko wysokie podobieństwo w składzie aminokwasowym do białek ludzkich, ale także mają podobne funkcje

• posiadają wszystkie cechy idealnego organizmu modelowego: krótki czas generacji, liczne potomstwo w krótkim czasie, materiał łatwo dostępny i tani, proste metody hodowli, gatunek niepatogenny, doświadczenia nie stanowią problemów etycznych

• mały genom (tylko 3,5 razy większy niż u E. coli); zawiera 16 chromosomów, które przypominają strukturą, mechanizmem replikacji, rekombinacji i segregacji swoje odpowiedniki z organizmów wyższych; drożdże są najlepiej poznanym pod względem genetycznym organizmem eukariotycznym; z

• nana jest obecnie pełna sekwencja DNA genomu drożdży i funkcja 66% genów; mała liczba genów łatwość intronami

• duża łatwość manipulacji genetycznych np. proste i skuteczne techniki wydajnej transformacji plazmidami, ukierunkowanej inaktywacji genów (u drożdży zachodzi bardzo wydajnie homologiczna rekombinacja), proste metody izolacji kwasów nukleinowych i białek

• łatwość indukcji mutacji; szybka identyfikacja fenotypu mutacji, dzięki możliwości manipulacji składnikami podłoży hodowlanych o ściśle zdefiniowanym składzie; łatwość izolacji mutacji (drożdże mają stabilny stan diploidalny i haploidalny, dzięki czemu recesywne mutacje mogą od razu manifestować swój fenotyp w komórkach haploidalnych i nie ma potrzeby konstruowania diploidalnych homozygot recesywnych; proste wykonanie testów komplementacji na alleliczność mutacji poprzez krzyżowanie form haploidalnych (zob. niżej)

• możliwość badania efektów mutacji oddechowych; mutacje te u drożdży nie są letalne, gdyż uruchamiana jest fermentacja alkoholowa jako beztlenowy sposób uzyskiwania energii

• drożdże mogą być doskonałymi gospodarzami do produkcji i badania białek heterologicznych czyli białek pochodzących od innych organizmów

Genom drożdży S. cerevisiae:

1. Genom jądrowy:

Genom jądrowy komórki haploidalnej składa się z 16 chromosomów o wielkości od 200 do 2200 tysiąca par zasad stanowią 85% całkowitej informacji genetycznej drożdży; pełna sekwencja genomu jądrowego o długości 12 mln par zasad została opublikowana w 1996 roku; zidentyfikowano 6604 otwartych ramek odczytu (czyli potencjalnych genów), z których 4365 (66,1%) ma opisaną funkcję, 1420 (21,5%) jest nieznanych, a 819 (12,4%) otwartych ramek odczytu uznaje się za „wątpliwe” (ang. „dubious”), które prawdopodobnie nic nie kodują. Informacja genetyczna na chromosomach jest silnie skondensowana (72% sekwencji zajmują geny) i tylko 3,8% genów zawiera introny, które występują licznie w genach kodujących tRNA (w 80 z 262 genów tRNA). Rybosomalne RNA kodowane są tandemowo i występują w 120 kopiach zlokalizowanych na chromosomie XII. Chromosomy zawierają także ruchome elementy genetyczne zwane retrotranspozonami (średnio 30 kopii).

W jądrze znajduje się również 60-100 kopii 2μm (dwumikronowego) plazmidu o długości 6318 par zasad, co stanowi około 5% informacji genetycznej drożdży; funkcja jest nieznana, gdyż szczep cir^o nieposiadający tego plazmidu ma identyczny fenotyp jak szczep cir+ zawierający plazmidy. Plazmidy 2μm dziedziczą się niezgodnie z prawami Mendla.

Geny jądrowe (formy zapisu):

• URA3 - gen typu dzikiego (duże litery, czcionka italic, trzy litery plus liczba)

• ura3 - allel recesywny (małe litery, czcionka italic)

• ura3-2 - nazwa allelu recesywnego

• ura3-Δ1 - mutacja recesywna typu delecji

• ura3::LEU2 - mutacja przez insercję innego genu typu dzikiego

• ura3Δ::LEU2 - mutacja delecji przez zastąpienie genu URA3 innym genem typu dzikiego

• Ura3 lub Ura3p - białko kodowane przez gen URA3

• Ura⁺ - szczep nie potrzebujący do wzrostu uracylu (szczep prototroficzny względem uracylu), wykazuje wzrost na podłożu minimalnym bez uracylu

• Ura⁻ - szczep wymagający do wzrostu uracylu (szczep auksotroficzny względem uracylu), nie wykazuje wzrostu na podłożu minimalnym bez uracylu

• YAR077w - otwarta ramka odczytu (ORF, potencjalny gen); Y (yeast, drożdże), A (chromosom I), R (right, prawe ramię chromosomu; L, gdy ORF położony jest na lewym ramieniu chromosomu), 077 (kolejny porządkowy numer ORFu na chromosomie), w (położenie ORFu na nici Watsona; ”c” w przypadku nici Cricka)

2. Genom cytoplazmatyczny:

RNA wirusy zbudowane są z dwuniciowego RNA i stanowią 0,1% informacji genetycznej drożdży; wyróżniamy pięć typów RNA wirusów: L-A (80%), L-BC (9%), M (10%), T (0.5%) i W (0.5%); wirus L-A koduje składniki kapsydu dla własnego RNA i RNA typu M, a RNA M koduje toksynę KIL (ang. killer toxin); dziedziczenie cytoplazmatyczne, niezgodnie z prawami Mendla.

Genom mitochondrialny stanowi 10% informacji genetycznej drożdży. DNA mitochondrialne (mtDNA) występuje w mitochondriach jako kolista, dwuniciowa cząsteczka DNA, ale może mieć również formę liniową. Długość mtDNA wynosi 74-86 tys. par zasad. Średnia liczba kopii w komórce wynosi 50 (8-130). mtDNA bogate jest w pary AT. Geny mitochondrialne szybko ewoluują, gdyż nie występują w mitochondriach skuteczne mechanizmy naprawy DNA (wysokie tempo mutacji). Pełną sekwencję genomu mitochondrialnego poznano w 1998 roku. W skład mtDNA wchodzą dwa geny kodujące rRNA, pełen zestaw genów tRNA (25 genów), gen kodujący białko rybosomalne (var1), gen kodujący RNA wchodzący w skład RNazy P biorącej udział w obróbce tRNA (9S RNA), 7 genów kodujących m.in. białka podjednostek ATPazy, oksydazy cytochromu c i apocytochromu b, a także 9 otwartych ramek odczytu o nieznanej funkcji. Geny mitochondrialne nie podlegają regułom genetyki mendlowskiej.

Trzy geny są podzielone (mozaikowe), tzn. składają się z intronów i eksonów: cox1 (maksymalnie 7 intronów), cytb (maksymalnie 7 intronów), LSU (1 intron). Introny mitochondrialne dzieli się na dwie grupy (I i II) i zdolne są one do samowycinania i przenoszenia się do miejsc homologicznych (introny mobilne). Zdolności te są warunkowane przez białka kodowane przez otwarte ramki odczytu zlokalizowane w samych intronach. Samowycinanie warunkowane jest przez maturazę, a rozprzestrzenianie przez endonukleazę. Przeniesienie intronu grupy I w homologiczne miejsce genu bezintronowego nazywamy „intron homing”, który polega na nacięciu genu bezintronowego przez endonukleazę kodowaną przez intron, a uszkodzenie DNA jest naprawiane na matrycy genu z intronem, czego wynikiem jest wstawienie intronu w nowe miejsce. Introny grupy II mogą kodować białka o potrójnej aktywności: maturazy, endonukleazy i odwrotnej transkryptazy, co umożliwia przeniesienie tego typu intronu w nowe miejsce poprzez odwrotną transkrypcję mRNA genu zawierającego intron w procesie zwanym „retrohoming”.

Typy mutantów oddechowych:

1. mitochondrialne (dziedziczenie cytoplazmatyczne niezgodnie z prawami Mendla):

1. rho^o (ρ^o) - mutacja polegająca na całkowitej utracie mtDNA, efekt fenotypowy jak w rho-,

2. rho⁻ (ρ⁻) - duże delecje do 50% genomu mitochondrialnego; wielkość nie ulega zmianie, ponieważ następuje podwojenie pozostałego fragmentu, ale zmienia się jakość

3. mit⁻ - punktowe mutacje lub niewielkie delecje w mtDNA (utrata aktywności konkretnych genów, synteza pozostałych białek odbywa się bez przeszkód; w przeszłości służyły do konstrukcji mapy genetycznej genomu mitochondrialnego)

4. rho⁺ (ρ⁺) - dziki typ mtDNA

2. jądrowe (dziedziczenie zgodnie z prawami Mendla):

1. pet - zmutowane geny jądrowe związane z biogenezą i funkcją mitochondriów

2. PET- dzikie geny związane z biogenezą i funkcją mitochondriów

PET - skrót od franc. „petite”: mutanty oddechowe tworzą małe kolonie na podłożu z glukozą, gdyż niemożliwy jest szybki wzrost z powodu niedoboru energii uzyskiwanej tylko z fermentacji.jądrowe (tzw. petity jądropet - mutacje w genach zaangażowanych w metabolizm, ekspresję lub strukturę genomu mitochondrialnego; około 300 produktów genów jądrowych może być zaangażowanych w biogenezę mitochondriów

Mutanty mitochondrialne nie są zdolne do wzrostu na podłożach z niefermentowalym źródłem węgla np. mleczanem, etanolem, glicerolem (podłoże N3 lub YPGlic).

Komórki zdolne do oddychania: PET rho⁺

Komórki niezdolne do oddychania: PET rho^o, PET rho⁻, PET mit⁻, pet rho⁺, pet rho^o, pet rho⁻

Dziedziczenie cytoplazmatyczne odnosi się do cech, dla których geny zlokalizowane są poza genomem jądrowym.

Podłoża do hodowli drożdży:

W środowisku naturalnych drożdże występują na powierzchni owoców np. winogron. W laboratorium drożdże hoduje się w temperaturze 30°C na podłożu płynnym w kolbach lub probówkach umieszczonych na wytrząsarce lub na podłożu stałym na płytkach Petriego.

Rodzaje podłoży hodowlanych:

• pełne YPG (1% Yeast extract - wyciąg drożdżowy, 2% Peptone, 2% Glucose)

• minimalne G0 (0,67% Yeast Nitogen Base - źródło azotu, 2% glukoza z dodatkiem lub bez suplementów); do selekcji mutantów auksotroficznych (wymagających do wzrostu jakiegoś składnika odżywczego); na podłożu minimalnym bez żadnych dodatków rosną tylko prototrofy

• pełne N3 (1% Yeast extract - wyciąg drożdżowy, 2% Peptone, 2% Glicerol); do selekcji mutantów oddechowych

• sporulacyjne SPM (1% octan potasu, 0,1% yeast extract, 0,05% glukoza)

Aby uzyskać podłoże stałe należy dodać także 2% agar.

Cykl życiowy drożdży:

Komórki drożdży mogą występować w dwóch formach haploidalnej i diploidalnej. Komórka diploidalna ma kształt elipsoidalny o wielkości 5 x 6 μm; komórka haploidalna ma kształt sferyczny i średnicę około 4 μm. Cechy te są jednak bardzo zmienne i w mikroskopie świetlnym bardzo trudno jest odróżnić komórkę haploidalną od diploidalnej. Obie formy rozmnażają się przez podziały wegetatywne (mitotyczne) w formie pączkowania, w którym komórka potomna jest inicjowana jako pączek na komórce matczynej; podczas wzrostu pączka następuje podział jądra komórkowego, a jedno z jąder przemieszcza się do pączka potomnego; następnie na granicy komórki matczynej i pączka potomnego tworzy się ściana komórkowa i może nastąpić oddzielenie komórki potomnej (Rys. 1). W pełnym podłożu komórki dzielą się co 90 min, a w minimalnym co 140 min. U diploidów kolejny pączek pojawia się na drugim biegunie komórki (pączkowanie bipolarne), a u haploidów kolejne pączki pojawią się w pobliżu miejsca powstanie pączka poprzedniego (pączkowanie aksjalne) (Rys. 2). Pączki pozostawiają na komórce matczynej charakterystyczne blizny, które mogą być uwidocznione prze fluorescencyjny barwnik calcofluor, który barwi chitynę obecną w miejscu połączenia pączka i komórki matczynej.

Rys. 2. Typy pączkowania.

W warunkach niedoboru składników odżywczych (głód) w komórkach diploidalnych dochodzi do mejozy i powstania 4 haploidalnych spor zamkniętych w worku. Jest to worek nieuporządkowany tzn. spory w worku są ułożone luźno i przypadkowo. W worku znajdują się 2 spory o typie płciowym a (MATa; MAT=mating) i 2 spory o typie płciowym α (MATα). Gdy pojawią się substancje odżywcze spory kiełkują dając początek pokoleniu haploidalnemu typu a lub α (Rys. 3).

Rys. 3. Cykl życiowy drożdży.

Schemat cyklu życiowego S. cerevisiae.

Komórki haploidalne rozmnażają się przez podziały mitotyczne. Połączenie dwóch komórek o przeciwnych typach koniugacyjnych a z α i różnych genomach mitochondrialnych prowadzi do powstania heteroplazmatycznej zygoty (koniugacja). Po kilku lub kilkunastu mitotycznych podziałach komórek diploidalnych a/α następuje segregacja cech mitochondrialnych i powstają homoplazmatyczne diploidy, o genotypach mitochondrialnych rodzicielskich i zrekombinowanych. W wyniku podziałów mejotycznych komórki diploidalnj powstają cztery haploidalne spory (sporulacja) o identycznym genotypie mitochondrialnym. Typ koniugacyjny i pozostałe markery jądrowe segregują w stosunku 2:2.

Komórki haploidalne typu a lub α wydzielają feromony w formie krótkich peptydów o nazwie a lub α. Komórki typu a posiadają receptory powierzchniowe dla feromonu α, a komórki typu α posiadają receptory powierzchniowe dla feromonu a. Gdy komórki przeciwnych typów koniugacyjnych znajdą się w pobliżu siebie (krzyżowanie, ang. „mating”), przyłączenie feromonów do receptorów aktywuje specyficzne kaskady sygnalne, które prowadzą do zahamowania cyklu komórkowego w fazie G1 (przerwa przed syntezą DNA), aglutynacji i zmiany kształtu komórki (morfogenezy). Komórki przyjmują kształt stożkowaty (ang. „shmooing”), szczytami kierują się ku sobie i dochodzi do fuzji obu komórek. Powstaje charakterystyczna figura koniugacyjna w kształcie hantli (biszkopta). Po zlaniu cytoplazmy dochodzi do fuzji jąder i powstaje zygota. Cały proces koniugacji trwa około 3 godzin. W końcu zygota tworzy pierwszy pączek dając początek pokoleniu diploidalnemu. W naturze przeważa pokolenie diploidalne, gdyż po kiełkowaniu spor bardzo szybko dochodzi do koniugacji między komórkami a i α (Rys. 3). Natomiast, gdy dojdzie do rozdzielenia komórek a i α i niemożności koniugacji, w niektórych komórkach dochodzi do zmiany typu koniugacyjnego na przeciwny (ang. mating type switch). Może dojść do koniugacji i powstania pokolenia diploidalnego. Szczep zdolny do zmiany typu koniugacyjnego nazywamy homotalicznym. Występują też szczepy heterotaliczne (m.in. szczepy laboratoryjne) niezdolne do zmiany typu koniugacyjnego, które w hodowlach utrzymują stan haploidalny. Heterotaliczność zapewnia mutacja w genie kodującym endonukleazę HO, która bezpośrednio bierze udział w molekularnym procesie zmiany typu koniugacyjnego. Komórka haploidalna posiada trzy kopie genów (kasety) warunkujące typ koniugacyjny w trzech różnych locus na chromosomie III (Rys. 4). Geny HMLα i HMRa kodują geny warunkujące odpowiednio typ koniugacyjny a i α, ale obie kopie są nieaktywne, gdyż ich loci leżą w regionach subtelomerowych, które podlegają „wyciszaniu” chromatyny, tzn. że chromatyna ulega w tych miejscach deacetylacji, w wyniku czego chromatyna jest ściśle upakowana i DNA jest niedostępny dla aktywatorów tranksrypcji. Aktywnie transkrypcyjnie jest jedynie locus MAT, w którym znajdować się może albo gen warunkujący typ a albo α. Zamiana jednego genu na drugi w locus MAT może nastąpić gdy zostanie przecięte DNA w jego obrębie przez endonukleazę HO. Powstałe w ten sposób uszkodzenie DNA jest naprawiane w procesie konwersji genów, gdzie uszkodzenie DNA jest naprawiane na matrycy cichej kopii genu kodującego przeciwny typ koniugacyjny. Całość procesu nazywamy transpozycją lub kasetowym modelem zmiany typu koniugacyjnego.

Rys. 4. Model kasetowy zmiany typu koniugacyjnego u drożdży.

Test komplementacji cis-trans:

Test ten służy do określenia czy dwie mutacje leżą w tym samym genie (mutacje alleliczne) czy w dwóch różnych genach (mutacje niealleliczne). Mutacje niealleliczne mogą leżeć w genach, których produkty białkowe biorą udział w różnych procesach metabolicznych lub w tym samym procesie. Ten drugi przykład jest bardziej interesujący, gdyż w tym przypadku mutacje niealleliczne mogą mieć taki sam fenotyp, chociaż leżą w innych genach. Test komplementacji jest szczególnie użyteczny do testowania alleliczności mutacji o tym samym efekcie fenotypowym.

U drożdży synteza adeniny jest procesem wieloetapowym, w którym bierze udział kilka enzymów i w którym powstają produkty pośrednie (Rys. 5). Zahamowanie syntezy może nastąpić na każdym z etapów pośrednich, ale efekt fenotypowy będzie zawsze ten sam, czyli brak zdolności do syntezy adeniny, czego obserwowalnym efektem genotypowym jest brak wzrostu mutanta drożdżowego na podłożu minimalnym bez adeniny. Załóżmy, że mamy dwa mutanty o takim właśnie fenotypie, ale nie wiemy czy mamy do czynienia z mutacjami w tym samym genie czy różnych. Aby to sprawdzić krzyżujemy ze sobą oba mutanty i testujemy wzrost powstałego doploida na podłużu minimalnym bez adeniny. Jeśli mutacje leżą w tym samym genie, to każda kopia danego genu będzie produkować nieaktywny enzym i synteza adeniny będzie wciąż zablokowana. Wynik testu będzie ujemny: brak komplementacji i brak zdolności do wzrostu na podłożu bez adeniny. Jeśli mutacje będą leżeć w różnych genach to każdy z haploidalnych mutantów wniesie niezmutowaną kopię drugiego genu i w diploidzie będą produkowane wszystkie enzymy niezbędne do syntezy adeniny. Wynik komplementacji będzie dodatni: przywrócenie zdolności do syntezy adeniny. Nazwa testu komplementacji cis-trans bierze się stąd, że w diploidzie dwie mutacje mogą leżeć na dwóch różnych chromosomach (układ trans), albo na tym samym chromosomie (układ cis). W układzie cis zawsze dochodzi do komplementacji, a w układzie trans tylko, gdy mutacje leżą w różnych genach (Rys. 5). Należy zaznaczyć, że w przypadku organizmów diploidalnych do krzyżowania testowego używamy homozygoty recesywne.

Rys. 5. Test komplementacji cis-trans

Opracowanie: dr Robert Wysocki

Krzyżowanie drożdży w osadzie

1. Pobrać po 300 l hodowli płynnych odpowiednich szczepów drożdżowych do probówki Eppendorfa wg schematu krzyżowania podanego w tabeli poniżej.

2. Zwirować mieszaninę komórek przez 15sek.

3. Przenieść próbówkę do łaźni wodnej o temp 30°C na godz. Podczas inkubacji nie wstrząsać probówek.

4. Osad komórek zawiesić i nakropić po 10 l na odpowiednie podłoże selekcyjne. Dla kontroli nakropić także po 10 l hodowli komórek szczepów rodzicielskich.

Krzyżówka	Symbol szczepu	Genotyp	Podłoże
I	A: 55R5-3C B: US51-10B	Mata ura1 Matα ura3	GO
II	A: US7-15D B: G199	Mata ade6 leu1 trp5 Matα ade1 mit^-	GO GO+ ade N3
III	A: PS303-2D B: G199	Mata ade1 mit^- Matα ade1 mit^-	GO GO+ ade N3
IV	A: AB1-4A/8/60 B: FD236-6D	Mata his PET ρ^ Matα ura3 ρ^	GO N3
V	A: AO404 B: FD236-6D	Mata his pet ρ^ Matα ura3 ρ^	GO N3

Rozwiązywanie zadań: 5-8, 11, 19-25.

1

Enzym 1 Enzym 2

3

Gen 2

Gen 1

Enzym 1 Enzym 2

1

Gen 2

Gen 1

Mutant 1 x Mutant 3

Enzym 1 Enzym 2

Enzym 1 Enzym 2

Enzym 1 Enzym 2

Enzym 1 Enzym 2

2

Gen 2

Gen 1

1

Gen 2

Gen 1

Mutant 1 x Mutant 2

Mutant 1 Mutant 2 Mutant 3

3

2

1

Gen 2

Gen 1

Gen 2

Gen 1

Gen 2

Gen 1

Enzym 1 Enzym 2

Gen 1 Gen 2

(adenina)

Substrat Produkt pośredni Produkt końcowy

trans

test „+”

trans

test „-”

Enzym 1 Enzym 2

Gen 1

Gen 2

Gen 1

Gen 2

Gen 1

Gen 2

1

2

Mutant 4 Mutant 5 Typ dziki

Mutant 4 x Typ dziki

Gen 1

Gen 2

1

Gen 1

Gen 2

2

Enzym 1 Enzym 2

Enzym 1 Enzym 2

Enzym 1 Enzym 2

Enzym 1 Enzym 2

Mutant 5 x Typ dziki

Gen 1

Gen 2

1

Enzym 1 Enzym 2

Gen 1

Gen 2

3

Enzym 1 Enzym 2

cis

test „+”

cis

test „+”

3

1

Enzym 1 Enzym 2

Rys. 1. Pączkowanie u drożdży - cykl wegetatywny

Pączkowanie aksjalne Pączkowanie bipolarne

Głód

Pokolenie

diploidalne

Pokolenie

haploidalne

Sporulacja

Koniugacja

„Shmooing””

Krzyżowanie

a

α

MATα

a

a

α

α

MATa

- różne genomy mitochondrialne typu rodzicielskiego

- różne genomy mitochondrialne zrekombinowane

HMLα

HMRa

MATα

HO

HMLα

HMRa

HMLα

HMRa

HMLα

HMRa

MATa

OFF ON OFF

OFF ON OFF

---