Analiza kumulacji metali ciężkich w organizmach II

Uszkodzenia aparatu fotosyntetycznego roślin w warunkach stresu wywołanego nadmiarem metali ciężkich I.

Ćwiczenie nr 1.

Wpływ pierwiastków na intensywność wzrostu koleoptyli pszenicy.

Do doświadczenia wybieramy pęsetą 6 porcji po 10 ziarniaków pszenicy równo skiełkowanych. Porcje skiełkowanych ziarniaków umieszczamy na potrójnej warstwie bibuły w szalkach Petriego wysyconej wodą destylowaną (kontrola) lub 1mM roztworami Cd, Cu, Pb, Ca, K w Cd(NO₃)₂, Cu(NO₃)₂, Pb(NO₃)₂ Ca(NO₃)₂, KNO_3. Na każdej z prób skiełkowanych ziarniaków dokonujemy pomiarów długości koleoptyli. Wynik pomiaru notujemy w rubryce próba wyjściowa. Po trzech i siedmiu dniach dokonujemy ponownego pomiaru długości koleoptyla w każdej z prób.

CZAS	Długość koleptyla
		kontrola	Cd(NO3)2	Cu(NO3)2	Pb(NO3)2	Ca(NO3)2	KNO3
Próba wyjściowa
3 DNI
7 DNI

Ćwiczenie nr 2.

Wpływ metali ciężkich na uszkodzenia fotosystemu PSII.

W ćwiczeniu wykorzystujemy gatunki roślin Phaseolus vulgaris, Zea mays które były narażone na nadmiar ołowiu, oraz rośliny które były przetrzymywane w warunkach kontrolnych.

Pomiarów parametrów fluorescencji dokonujemy przy użyciu fluorymetru FMS 1. Pomiar fluorescencji chlorofilu jest prostym, nie destrukcyjnym i bardzo szybkim narzędziem pomiarowym, daje odpowiedź na temat stanu fizjologicznego, w jakim znajduje się roślina. Pomiary i analiza parametrów fluorescencji chlorofilu a w ostatnich latach przeżywa rozkwit. FMS 1 służy do wykonywania szybkich i dokładnych pomiarów fluorescencji chlorofilu. Parametry mierzalne w trakcie pomiaru (F₀, F_v, F_m, F_v/F_m) są pomocne w ocenie stanu i funkcjonowania fotosystemu II w fazie jasnej fotosyntezy. Czynniki stresowe wpływają na funkcjonowanie PS II. Aparat ten jest szczególnie użyteczny w określaniu wpływu czynnika stresowego na aparat fotosyntetyczny w warunkach naturalnych lub laboratoryjnych.

Źródłem wzbudzającym fluorescencję w tym urządzeniu jest światło aktyniczne w zakresie 330-660 nm z maksimum przy długości fali 500 nm. Podczas pomiarów będziemy stosować następujące ustawienia: aklimacja do ciemności za pomocą firmowych klipsów przez 20 minut, intensywność światła wzbudzającego 1000 µmol ^. m^{-2 .} s^-1, czas pomiaru 1 s.

Będą analizowane następujące parametry fluorescencji.

F_v/F_m - potencjalna wydajność kwantowa fotosystemu II (PS II). Wartość tego parametru jest często stosowanym wskaźnikiem uszkodzeń wywołanych różnymi czynnikami stresowymi,

F₀ - minimalna wydajność fluorescencji, która określa stałą fluorescencję charakterystyczną dla otwartych centrów reakcji. Wartość F₀ nie jest stała i może rosnąć lub obniżać się kiedy uszkodzone są centra PS II, albo jeśli przekazywanie energii z anten do centrów rekcji jest hamowane,

F_m - maksymalna wydajność fluorescencji, obserwowana gdy wszystkie centra reakcji PS II są zamknięte,

F_v= (F_m-F₀) maksymalna zmiana wartości między F₀ a F_m, F_v jest parametrem proporcjonalnym do wydajności kwantowej PS II. Wartości zbliżone do zera mogą świadczyć o uszkodzeniu PS II i rozpraszaniu energii w postaci ciepła.

Rośliny traktowano 3mM Pb w Pb(NO₃)₂ doglebowo poprzez podlewanie odpowiednim roztworem. Ponad to rośliny fasoli i kukurydzy traktowano dolistnie tym samym roztworem .

		F0	Fm	Fv/Fm	Fv
Phaseolus vulgaris	Kontrola
		traktowane doglebowo 3mM Pb w Pb(NO3)2
		traktowane dolistnie 3mM Pb w Pb(NO3)2
	Zea mays	Kontrola
		traktowane doglebowo 3mM Pb w Pb(NO3)2
		traktowane dolistnie 3mM Pb w Pb(NO3)2

Ćwiczenie nr 3.

Wpływ zawartości metali ciężkich w środowisku na zmiany zawartości chlorofilu.

W ćwiczeniu zostanie porównana zawartość chlorofilu u roślin C₃ (Phaseolus vulgaris) i C₄, (Zea mays) (kontrola) oraz u takich, które były narażone na działanie nadmiaru metali ciężkich 3mM Pb w Pb(NO₃)₂

metoda Barnesa i wsp. (1992)

Zawartość chlorofilu oznaczona zostanie według metody Barnesa i wsp. (1992). Określona ilość materiału została przeniesiona do pojemników z 3 ml sulfotlenku dimetylu. Tak przygotowane pojemniki umieszczamy w cieplarce na 4 godziny w temperaturze 65^o C w celu ekstrakcji barwników. Ekstrakt następnie zostanie przelany do kuwety pomiarowej, a oznaczenie ilości chlorofilu a i b zostanie wykonane przy użyciu spektrofotometru firmy CECIL 9500. Absorbancję oznaczymy przy długości fali: λ = 665 i 648 nm. Ilość chlorofilu zostanie przeliczona na stężenie w świeżej masie według wzorów.

METODA z DMSO (1992)

_{Chlorofil a =} (14,85·A₆₆₅ - 5,14·A₆₄₈)·V

1000 · W

_{Chlorofil b =} (25,48·A₆₄₈ - 7,36·A₆₆₅)·V

1000 · W

_{Suma a + b =} (7,49·A₆₆₅ + 20,34·A₆₄₈)·V

1000 · W

gdzie:

A - absorbancja przy danej długości fali,

V - całkowita objętość ekstraktu (cm³),

W - masa próbki (g).

METODA Z DMSO		CHLOROFIL
				a	b	a+b	a/b
KONTROLA	Phaseolus vulgaris
		Zea mays
	3mM Pb w Pb(NO3)2	Phaseolus vulgaris
		Zea mays

Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Uniwersytet Pedagogiczny im. Komisji Edukacji Narodowej ul. Podchorążych 2, 30-084 KRAKÓW www.up.krakow.pl

---