POLITECHNIKA ŚLĄSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii

Otrzymywanie ekstraktów enzymatycznych z materiału biologicznego

Prowadzący: mgr inż. Agata Ptaszek

Opracowała: mgr inż. Agata Ptaszek

CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia jest uzyskanie enzymu tyrozynazy z trzech naturalnych źródeł: pieczarki, banana i ziemniaka oraz oznaczenie wydzielonego białka metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie.

PODSTAWY TEORETYCZNE:

Wykonanie szybkiej i wydajnej izolacji enzymu wymaga spełnienia kilku podstawowych

warunków:

1. Wybór dobrego źródła enzymu (tkanki roślinne, zwierzęce, komórki mikroorganizmów), przy zwróceniu uwagi na:

• łatwość i wydajność separacji interesującego enzymu

• dostępność oraz koszt uzyskania surowca

• właściwości otrzymywanego enzymu (np. enzymy o dużej termostabilności musimy izolować najczęściej z organizmów termofilnych)

Obecnie coraz częściej w celu uzyskania potrzebnych białek doprowadza sie do ich nadprodukcji w komórkach bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach komórek ssaczych. Otrzymane w ten sposób białka nazywane są białkami rekombinowanymi. Zaletą tych technik jest możliwość otrzymania dużej ilości potrzebnego białka, a jego oczyszczanie do homogenności jest stosunkowo proste.

2. Zachowanie warunków pozwalających na otrzymanie enzymu bez utraty jego aktywności katalitycznej, tj. :

• utrzymanie odpowiedniej temperatury (najczęściej ok. 0^oC) i pH (najczęściej w granicach 5-9),

• ograniczenie denaturacji powierzchniowej (tj. pienienia roztworów) oraz

inaktywacji przez metale ciężkie

• zabezpieczenie przed działaniem proteaz

• zapewnienia wysokiej czystości pracy, aby nie doprowadzać do wtórnego

zanieczyszczenia proteazami i innymi substancjami hamującymi aktywność

Dla każdego enzymu powinno sie zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne. Pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje sie w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak: degradacje ścian komórkowych przez lizozym, rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego, sonifikację (pękanie komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradźwiękami) oraz homogenizacje, rozcieranie z piaskiem lub perełkami szklanymi i inne metody mechaniczne. Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają sie procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy.

Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo różnorodne i ich stosowanie zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia enzymu.

Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:

• frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)

• ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).

Metody te opierają sie na odciąganiu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworzą białka (w tym enzymy). Ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi rożne ilości grup kwasowych i zasadowych, ich rozpuszczalność zależy od stężenia rozpuszczonej soli, polarności i pH rozpuszczalnika oraz temperatury. Dlatego pewne białka wypadają z roztworu, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny. Przez odpowiedni dobór stężenia soli odwadniających można przeprowadzić ich stopniowe wytracanie, np. odwodnienie globulin nastąpi już przy 50 %-wym wysyceniu roztworu siarczanem amonu, a albumin dopiero przy całkowitym wysyceniu roztworu siarczanem amonu. Mieszające sie z wodą rozpuszczalniki organiczne, takie jak etanol czy aceton, obniżają zdolność działania wody jako rozpuszczalnika, dzięki czemu bardzo dobrze strącają białka. Mieszaninie z wodą w różnych proporcjach pozwalają na wybiórcze strącanie białek. Proces ten należy prowadzić w temperaturze 0^oC lub niższej, ponieważ w wyższych temperaturach nastąpi ich denaturacja.

Otrzymane osady białkowe oddzielane są metodami filtracji lub wirowania. Następnie są rozpuszczane, a w przypadku wykorzystywania procesów wysalania mogą być poddawane dializie.

Dializę stosuje sie w celu usunięcia niskocząsteczkowych związków (np. soli) z roztworu białka, umieszczonego wewnątrz półprzepuszczalnej membrany. Na zewnątrz znajduje się roztwór o niskiej sile jonowej. Niskocząsteczkowe substancje, dążąc do wyrównania ciśnień osmotycznych po obu stronach membrany dializacyjnej, migrują przez nią do otaczającego roztworu.

Kolejnymi etapami, stosowanymi dla dalszego oczyszczania preparatów enzymatycznych, mogą być:

• chromatografia

• elektroforeza

• ultrawirowanie

Tyrozynaza (EC 1.14.18.1) jest enzymem należącym do klasy oksydoreduktaz. Jest on enzymem szeroko rozpowszechnionym w organizmach żywych. Obecność tego enzymu stwierdza się zarówno w mikroorganizmach, jak i w komórkach roślinnych. Natomiast w organizmach ssaków największą aktywność tyrozynazy wykrywa się w melanocytach, ponieważ jest to metaloenzym glikoproteinowy uczestniczący w procesie melanogenezy, w wyniku którego jest produkowana melanina barwnik nadający charakterystyczne zabarwienie skóry.

Enzym ten aktywowany jest promieniowaniem UV. Do aktywacji tyrozynazy jest niezbędny aminokwas tyrozyna oraz niektóre jony.

W procesie melanogenezy tyrozynaza (hydroksylaza tyrozynowa, HT), katalizuje ortohydroksylację tyrozyny do L-DOPA, a następnie zostaje ona przekształcana w dopaminę poprzez dekarboksylazę DOPA (AADC). Dopamina może być następnie wykorzystana do syntezy noradrenaliny i adrenaliny w reakcjach katalizowanych przez hydroksylazę dopaminową (DBH) oraz N-metylotransferazę fenyloetanoloaminową (PNMT) (rys 1.).

Rysunek 1. Schemat biosyntezy amin katecholowych w organizmie ludzkim

WYKONANIE ĆWICZENIA:

Sprzęt:

• lejek oraz bibuła filtracyjna

• mikser

• wirówka

• zlewki

• probówki typu eppendorf na 1.5 ml i typu Falcon na 15 ml

Materiały i odczynniki:

• 100 g świeżych pieczarek/bananów/ziemniaków

• nasycony roztwór (NH₄)₂SO₄ (4.1 M w 25° C)

• 0.1M buforu cytrynianowego o pH 4.8

• 0.1M NaF

• lód

PRZYGOTOWANIE BUFORU CYTRYNOWEGO (PH 3.0-6.2, PK_A = 6.40)

A: 0.1 M Kwas cytrynowy (M= 192.12 g/mol) ; B: 0.1 M Cytrynian sodu (M=214.12 g/mol)

X ml A + Y ml B i dodać 50 ml H₂0

0.1 M citric acid	0.1 M sodium citrate	pH
46.5	3.5	3.0
43.7	6.3	3.2
40.0	10.0	3.4
37.0	13.0	3.6
35.0	15.0	3.8
33.0	17.0	4.0
31.5	18.5	4.2
28.0	22.0	4.4
25.5	24.5	4.6
23.0	27.0	4.8
20.5	29.5	5.0
18.0	32.0	5.2
16.0	34.0	5.4
13.7	36.3	5.6
11.8	38.2	5.8
9.5	41.5	6.0
7.2	42.8	6.2

Procedura:

1. Otrzymywanie enzymu z preparatów roślinnych

1. Banany i ziemniaki obrać, z kapeluszy pieczarek zdjąć skórkę. Pokroić około 100 g pieczarek/banana/ziemniaka na drobne kawałki. Pokrojone pieczarki/ banany/ziemniaki umieścić w mikserze i dokładnie rozdrobnić.

*UWAGA! dalsze czynności należy wykonywać w rękawiczkach ze względu na toksyczny NaF

2. Wszystkie następne czynności wykonywać w temperaturze 2-4ºC (w łaźni lodowej).

Odważyć 10 g rozdrobnionej próbki. Przenieść do szklanej zlewki i zalać 10 ml 0.1 M NaF i dokładnie wymieszać.

3. Pobrać 200 µl otrzymanego roztworu do czystej probówki eppendorf i podpisać
   (nr grupy, roślina, data, NR 1).

4. Uzyskany homogenat przesączyć przez bibułę filtracyjną umieszczoną w lejku. Osiadły na bibule osad wyrzucić. Zmierzyć objętość przesączu i dodać taką samą objętość nasyconego (NH₄)₂SO₄.

5. Otrzymany w ten sposób roztwór przenieść po 6.0 ml do 4 probówek typu Falcon na 15 ml. Po zrównoważeniu, wszystkie probówki włożyć do wirówki i wirować przez 10 minut z prędkością 1,500 x g.

6. Po usunięciu supernatantu, pozostałe w probówkach osady rozpuścić dodając po 1.5ml 0,1 M buforu cytrynianowego pH 4.8, następnie zebrać do jednej probówki typu Falcon na 15 ml i dodać resztę 0,1 M buforu cytrynianowego pH 4.8, tak by objętość dodanego buforu wynosił 10 ml. Dokładnie wymieszać, tak by wszystkie grudki osadu się rozpuściły. Wytrząsać na wytrząsarce przez około 2 minuty, co jakiś czas chłodząc próbkę w łaźni lodowej.

7. Ponownie przenieść roztwór do nowych probówek typu Falcon (15ml) po 6 ml (lub odpowiednio mniejszej liczby) następnie zrównoważyć probówki, włożyć wszystkie probówki do wirówki i wirować przez 10 minut z prędkością 300 x g. Otrzymany supernatant jest roztworem zawierającym badany enzym!!

8. Pobrać 200 µl otrzymanego roztworu do czystej probówki eppendorf i podpisać
   (nr grupy, roślina, data, NR 2)

9. Delikatnie zebrać supernatant do nowej próbówki na 15 ml w celu oznaczenia aktywności tyrozynazy i podpisać (imię i nazwisko, data, nazwa rośliny, z której

otrzymano enzym)

10. Próbkę przechowywać w stanie zamrożonym do czasu wykonania dalszych eksperymentów.

2. Oznaczenie białka metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie

Większość białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali λ=280 nm. Związkami mogącymi wpływać na wielkość absorbancji w λ=280 nm są kwasy nukleinowe. Maksimum absorpcji dla kwasów nukleinowych występuje przy
λ=260 nm. Ze względu na wpływ wszystkich składników roztworu otrzymanego białka poniższa metoda pozwala na oszacowanie przybliżonej zawartości białka w preparacie.

Materiały i odczynniki:

• Roztwory Nr 1 i Nr 2

Procedura:

1. ustawić urządzenie na pomiar przy długości fali λ = 280 nm

2. skalibrować spektrofotometr względem próbki referencyjnej

3. umieścić 10 µl badanego roztworu Nr 1 i uzupełnić 990 µl roztworem stosowanym jako próbka referencyjna

4. oznaczyć absorbancję przy długości fali λ = 280 nm

5. ustawić urządzenie na pomiar przy długości λ = 260 nm

6. skalibrować spektrofotometr względem próbki referencyjnej

7. umieścić kuwetę z badanym roztworem i oznaczyć absorbancję przy λ = 260 nm

8. obliczyć stężenie białka ze wzoru (szerokość kuwety 1cm):

Stężenie białka (mg/ml) = (1.55 x A280) - (0.76 x A260)

9. pomiary powtórzyć dla w roztworu Nr 2.

OPRACOWANIE SPRAWOZDANIA:

• W sprawozdaniu proszę umieścić krótki wstęp teoretyczny na temat tyrozyny podając odnośniki literaturowe, następnie umieścić obserwacje dokonane w trakcie doświadczenia i odpowiedzi na poniższe pytania dotyczące wykonania ćwiczenia:

1. W jakim celu dodajemy do rozdrobnionych roślin NaF?

2. W jakim celu dodajemy do homogenizatu roztwór (NH4)2SO4?

3. Czym różni się wysalanie białka od denaturacji. Wyjaśnij na czym polegają obydwa procesy.

4. Dlaczego ekstrakcję enzymu prowadzimy w możliwie najniższej temperaturze? Zaproponuj inny, niż obniżenie temperatury, sposób zminimalizowania tego niekorzystnego zjawiska.

5. Mając do dyspozycji 1L buforu cytrynianowego (pH 4.8) o stężeniu 0.5 M, wykonaj obliczenia i napisz jak otrzymać 200 ml buforu cytrynianowego o stężeniu 0.15 M.

6. Podaj obliczone stężenia białka w roztworach Nr 1 i Nr 2, pamiętaj o rozcieńczeniu.

2

OBSERWACJA: Co się stało w zlewce po dodaniu NaF?

OBSERWACJA: Co się stało w zlewce po dodaniu (NH₄)₂SO₄?

OBSERWACJA: Jakiego koloru jest otrzymany preparat, czy jest przezroczysty?

---