BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA:

1. PATENTY W BIOTECHNOLOGII:

Patent - prawo wydane osobie do zabronienia innym osobom zarobkowego bądź zawodowego korzystania z danego wynalazku

Cechy patentowalności: nowość, nieoczywistość, komercyjność, odtwarzalność opisu technologicznego

• Wyłączenia z ochrony patentowej:
  -odkrycia w przyrodzie - w celu uniknięcia monopolizacji dóbr natury w ich stanie naturalnym
  *ochronie podlega metoda otrzymywanie danej substancji,
  -metody chirurgiczne i terapeutyczne w odniesieniu do człowieka lub zwierzęcia - są pozbawione charakteru przemysłowego,
  -metody otrzymywania nowych odmian roślin oraz ras zwierząt,
  *ochronie podlega mikroorganizmy powstałe w wyniku modyfikacji przez zastosowanie inżynierii genetycznej,
  -odkrycia sprzeczne z normami etyczno-moralnymi oraz legislacją.

• Zalety ochrony patentowej:
  -produkt lub proces jest chroniony przed konkurencją,
  -odkrywca ma zapewnione korzyści materialne,
  -opisy patentowe pozwalają uniknąć powielania badań, a jednocześnie stymulują postęp prac badawczych.

- patenty umożliwiają rozwój wymiany informacji technicznej

• Okres ochrony patentowej: UE, w tym Polska (20 lat, od zgłoszenia), USA (17 lat, od przyznania), Japonia (15 lat, od opublikowania)

Techniki objęte patentowaniem w inżynierii genetycznej:
-izolacja i identyfikacja genów;
-modyfikacja genów,
-transfer genów,
-wprowadzania zmodyfikowanych układów (w tym genów) prowadzące do modyfikacji organizmów.

- zmodyfikowane geny

- nowe układy biologiczne ( np. mikroorganizmy)

• Przykłady patentowania żywych organizmów:
  MIKROORGANIZMY:

-bakterie degradujące olej,
-zmodyfikowane drożdże do produkcji piwa i innych alkoholi

ROŚLINY:
-zboża o zwiększonej zawartości białka,
-rośliny z wbudowaną odpornością na owady

- rośliny odporne na patogeny

ZWIERZĘTA:
-zwierzęta gospodarskie o przyśpieszonym wzroście

- mysz z obniżona odpornością immunologiczną

2. GENETYKA A BIOTECHNOLOGIA:

Chromosom- forma organizacji materiału genetycznego wew. Komórki, chromosom określa płeć,

U organizmów prokariotycznych chromosom stanowi pojedyncza, kolista cząsteczka

U organizmów eukariotycznych chromosom to liniowa cząsteczka.

Rekombinacja (w obrębie dwóch komórek) - wymiana oraz łączenie materiału genetycznego między chromosomami:
-ogólna (duże odcinki DNA),
-miejscowa, nieuprawniona (małe odcinki DNA),
-plazmidowa (przenoszenie wolnego DNA).

Metody przenoszenia materiału genetycznego:

Koniugacja - wymiana DNA poprzez połączenie dwóch komórek za pomocą mostków pilusowych:
-Staphylococcus, Pseudomonas
F⁺ (męska z plazmidem) → F^- (żeńska bez plazmidu) F⁺ (męska z plazmidem) → F⁺ (rekombinant).;

Szczep bakterii coli, zawierający plazmid kodujący białko, odpowiedzialne za wytwarzanie struktur komórkowych zwanych pilami, posiada typ F+.

W przeciwieństwie do tego szczepu F- nie posiada takowego plazmidu. Gdy dochodzi do spotkania dwóch bakterii o odmiennych typach płciowych, pile wytworzone przez bakterie typu F+, przenikają przez ścianę komórkową bakterii płci F- i następuje wymiana materiału genetycznego (DNA).

Transformacja - pobieranie DNA przez komórki, które są w stanie kompetencji (protoplastyzacji):
-Bacillus, Rhizobium, Streptococcus;

Polega na zmianie genomu komórki na skutek pobrania cząsteczek DNA ze środowiska

Transdukcja - przenoszenie DNA przez bakteriofagi:
-ogólna - opuszczenie genomu, wniknięcie do cytoplazmy i wydostanie się na zewnątrz (brak efektu),
-specyficzna - opuszczenie genomu z częścią nowego DNA, infekcja kolejnej bakterii i wprowadzanie część nowego DNA od poprzedniego gospodarza, powstaje rekombinant (jest efekt).

Budowa RNA i DNA:

Skład chemiczny i właściwości	DNA	RNA
Cukier pięciowęglowy	deoksyryboza	ryboza
Zasady azotowe purynowe	adenina, guanina	adenina, guanina
Zasady azotowe pirymidynowe	cytozyna, tymina	cytozyna, uracyl
Reszta kwasu	fosforowego	fosforowego
Liczba łańcuchów	2	1
Rodzaje kwasów nukleinowych	Jeden rodzaj DNA	Kilka rodzajów RNA, np. informacyjny, transportujący, rybosomalny
Spełniane funkcje	Źródło informacji genetycznej, synteza białek	mRNA zawiera kopię kodu i przenosi ją na rybosomy tRNA transportuje aminokwasy do rybosomów rRNA bierze udział w biosyntezie białka

Organizmy haploidalne i diploidalne:

Organizmy haploidalne: organizmy, które maja pojedynczą liczbę chromosomów. W haploidalnej komórce nie występują chromosomy homologiczne.

Organizmy diploidalne: to organizmy wyższe, zawierają więcej niż 1 chromosom

Pojęcie genu:

Gen: to najmniejsza jednostka dziedziczności. To ciąg nukleotydów w łańcuchu DNA genomu. Pojedynczy gen koduje za pośrednictwem mRNA pojedynczy łańcuch polipeptydowy lub inną cząsteczkę RNA.

Ekson (egzon) - kodująca część cząsteczki DNA, ulegając transkrypcji pojawia się w dojrzałej cząsteczce RNA. Może kodować element białkowy.

Intron - niekodująca część cząsteczki DNA, ulega transkrypcji, jest wycinany podczas obróbki potranskrypcyjnej, w procesie splicingu

Zależność między transkrypcją, translacją i replikacją:

Replikacja: to proces w którym podwójna nic DNA ulega skopiowaniu.

Transkrypcja: to proces przepisania informacji zawartej w DNA na mRNA zachodzącym w jądrze komórkowym.

Translacja: to proces zachodzący na rybosomach, polegający na przetłumaczeniu informacji zawartej w mRNA w kolejność ułożenia nukleotydów, tworzących kodon, na kolejność ułożenia aminokwasów w białko.

Znaczenie plazmidów jako wektorów w przenoszeniu materiału genetycznego:

Plazmid: dwuniciowa, kulista, pozachromosowa cząsteczka DNA.

Dobry wektor tego typu powinien zawierać miejsca rozcinane przez enzymy restrykcyjne, przy czym z reguły dany plazmid posiada kilka takich miejsc dla kilku różnych enzymów. Miejsca te są zwykle zgromadzone w pojedynczym obszarze, zwanym polilinkerem. Żeby wprowadzić obcy DNA do wektora, należy wyciąć żądany fragment (gen) z większej cząsteczki (np. chromosomu lub innego plazmidu) za pomocą enzymu restrykcyjnego, który pozwala na uzyskanie wolnych końców, które można połączyć z wolnymi końcami przeciętego plazmidu. Mogą to być komplementarne lepkie końce lub tępe końce. Obcy DNA łączy się z plazmidem w reakcji prowadzonej przez enzym ligazę. Do wprowadzenia plazmidów do wnętrza komórki bakteryjnej przydatna jest metoda zwana transformacją.

Cechy przenoszone przez plazmidy:

- zdolność do koniugacji

- wykorzystywanie sacharozy

- oporność na antybiotyki

-oporność na jony metali ciężkich

- produkcja antybiotyków i bakteriocyn

Mutacje i rekombinacje charakterystyka i różnice:

Mutacje są to zmiany normalnej sekwencji DNA organizmu spowodowane działaniem czynników chemicznych i fizycznych lub błędami w replikacji DNA. Mutacje są utrwalane w wyniku podziałów komórkowych. Rodzaj mutacji i skutek jej działania są określone przez genotyp i fenotyp.

Rekombinacja ogólna jest procesem wymiany fragmentów DNA między chromosomami (lub dwuniciowymi helisami DNA), które mają długi wspólny, homologiczny region. Dwie homologiczne dwuniciowe helisy DNA (lub chromosomy) ustawiają się wówczas równolegle, następuje ich przerwanie i ponowne połączeni, z wymianą kodonów.

Najważniejszą różnicą między mutacjami a rekombinacją jest taka, że mutacje to proces niekontrolowany, natomiast rekombinacje z użyciem faga są bardzo precyzyjne. Ponadto mutacje są najczęściej niekorzystne, natomiast rekombinacje prowadzą najczęściej do poprawy właściwości produkcyjnych.

Genotyp: to skład genetyczny danego organizmu

Fenotyp: to ogół cech organizmu. Charakterystyka fenotypu tworzona jest przez ekspresje genów

Mutageneza: powstawanie i utrwalanie się mutacji w DNA komórek lub RNA wirusów; może być wynikiem samorzutnych błędów w procesach: replikacji DNA i reperacji DNA, a także efektem działania mutagenów uszkadzających DNA

Nukleozyd: związek zbudowany z zasady azotowej i pentozy połączonych wiązaniem N- glikozydowym

Nukleotyd: to podstawowy składnik budulcowy kwasów nukleinowych. Zbudowany jest z cukru- pentozy z 1 reszty fosforanowej i zasady azotowej.

3. WYDZIELANIE I OCZYSZCZANIE PRODUKTÓW FERMENTACJI:

Wydzielenie biomasy mikroorganizmów:

We wgłębnych hodowlach drobnoustrojów, podstawowym procesem technologicznym po zakończeniu hodowli jest wydzielenie biomasy z płynu pohodowlanego.

W praktyce przemysłowej stosuje się:

- FILTRACJĘ

- FLOKULACJĘ I SEDYMNETACJĘ

-WIROWANIE

Rozmiary bakterii mieszczą się zwykle w przedziale 0,2-2µm. Komórki drożdży mają rozmiary dochodzące do 20µm. Promieniowce oraz grzyby tworzą aglomeraty składające się z nitkowatych komórek o długości do kilkudziesięciu mikrometrów.

Przechowywanie szczepów:

Pasażowanie - wielokrotne przenoszenie bakterii z jednej pożywki na następną (prosta i tania, ale utrata cech biotechnologicznych).

Liofilizacja - sublimacja w stanie zamrożenia (-40/-50°C), tudzież faza stała przechodzi bezpośrednio w fazę gazową (usunięcie 70% wody), w warunkach normalnych lub pod zwiększonym ciśnieniem oraz z substancjami higroskopijnymi (chlorek wapnia):
*aktywizacja - uwodnienie (woda, mleko lub bulion), posiew (podłoże stałe, umożliwiające pełne ujawnienie cech przemysłowych),
-mikroorganizmy przetrwalnikujące - komórki z l-2-tygodniowej hodowli,
-mikroorganizmy nieprzetrwalnikujące - komórki z fazy stacjonarnej wzrostu,
-zalecane są podłoża minimalne (do namnażania przed przechowywaniem).

Zamrażanie:
-mikroorganizmy na skosach agarowych - w -20°C lub -5°C, do 6 miesięcy,
-spory grzybów strzępkowych w zawiesinie wodnej - ok. 5°C,
-przetrzymywanie w ciekłym azocie - w -196°C, do kilku miesięcy,
*aktywizacja - uwodnienie (szybkie przejście z -45°C do -5°C w łaźni wodnej), posiew (podłoże stałe lub płynne).

Rozbijanie ścian komórek - jest stosowane, gdy metabolit nie został wydzielony na zewnątrz.

Dezintegracja komórek jest etapem w którym jest możliwe wydzielanie do roztworu zawartości całej komórki.

Metody mechaniczne:
-w fazie ciekłej: ultradźwięki, ciśnienie, mieszanie,
-w fazie stałej: rozcieranie.

Metody niemechaniczne:
-odwadnianie: powietrzem, próżniowe, rozpuszczalnikami,
-liza: fizyczna, chemiczna, enzymatyczna, biologiczna.

Dezintegracja komórek na skale laboratoryjną:
-dezintegratory wysokoobrotowe - wytworzenie dużych naprężeń ścinających w roztworze,
-dezintegratory ultradźwiękowe - wytworzenie fal kawitacji, czyli powstawania wewnętrznych pęcherzy powietrzna w komórce,
-metody enzymatyczne - stosowanie enzymów proteolitycznch,
-zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny komórek - powstawanie kryształów lodu,
-operacje termiczne i suszenie,
-szok osmotyczny - przetrzymywanie w roztworach hipotonicznych,
-metody chemiczne - stosowanie ługów, kwasów, detergentów, antybiotyków lub rozpuszczalników organicznych,
-metody biologiczne - zastosowanie fagów.

Dezintegracja komórek na skale przemysłową:
-metoda ciśnieniowa - zastosowanie wysokiego ciśnienia (60-100 MPa), ochłodzenie (do 4˚C) i sprężenie mieszaniny. Metoda ta stosowana jest do prowadzenia procesu w dużej skali, największe aparaty mają wydajność do 6 m³/h ale w wielu wypadkach nie jest to metoda najbardziej efektywna.
-mielenie w młynach kulowych - poziome bębny wypełnione kulkami szklanymi o średnicy 0,3-0,4 mm.

Sprawnośc zależy od stężenia biomasy. Optymalne stężenia wynoszą od 30-60% masowych w odniesieniu do wilgotnej biomasy.

Oddzielnie ciał stałych i cieczy.

Filtracja:

Metody filtracji wykorzystują separacyjny efekt występujący podczas przepływu zawiesiny przez odpowiednia przegrodę:
-plackowa - zatrzymywanie cząstek stałych na placku filtracyjny (izolacja drożdży, grzybów),
-objętościowa - zatrzymywanie cząstek stałych na przegrodzie filtracyjnej, w metodzie tej chodzi o czystość filtratu (przesączu), a nie o wydzielenie osadu (izolacja etanolu),
-dynamiczna - szybkoobrotowe mieszadło lub obracający się filtr nie dopuszcza do powstawania placka, następuje zatężanie a nie osadzanie się zawiesin.

Sedymentacja - opadanie osadu prowadzone w odstojnikach, konieczna jest wstępna obróbka, w celu powstania aglomeratów.

Sedymentacja jest najprostszą technika stosowaną do rozdzielenia zawiesin. Z uwagi na małe rozmiary bakterii, niezbędna jest wstępna obróbka zawiesiny polegająca na aglomeracji komórek.

Flokulacja - wytrącanie osadu w wyniku neutralizacji ładunków na powierzchni komórek, powodowana dodatkiem odpowiednich elektrolitów, np. sole nieorganiczne, hydrokoloidy.

Flokulacja zależy od wielu czynników: temperatury, pH i siły jonowej roztworu oraz własności komórek i ich stanu fizjologicznego. Skuteczność flokulacji zależy przede wszystkim od wielkości naprężeń ścinających w roztworze oraz od stanu powierzchni błony komórkowej.

Flotacja - otaczanie zanieczyszczeń pęcherzykami powietrza i wypychanie ich na powierzchnię.

Dobre efekty uzyskuje się przez zastosowanie flotacji do wzbogacenia płynu w drobnoustroje. W procesie tym cząsteczki adsorbowane są na powierzchni pęcherzy gazowych, przepływających przez zawiesinę.

Wirowanie - zastosowanie siły odśrodkowej umożliwia zwiększenie efektu separacyjnego, nawet przy nieznacznych różnicach gęstości między cząsteczkami stałymi i cieczą.
- wirówki sedymentacyjne służą, jako separatory do otrzymywania zagęszczonej zawiesiny biomasy
- wirówki filtracyjne stosowane są do końcowego wydzielania biomasy oraz różnego typu stałych produktów biosyntezy.

Zagęszczanie roztworów:

Odparowanie - sposób oddzielenia cieczy od substancji stałej, stosowane, gdy trzeba odzyskać rozpuszczalnik, wadą jest pienienie.

Ekstrakcja - mieszanie z rozpuszczalnikiem słabo rozpuszczalnym dla cieczy, ale dobrze rozpuszczalnym z żądanym składnikiem,
np. ekstrakcja penicyliny octanem butylu z płynu pofermentacyjnego (pH 2,5-3), następnie re-ekstrakcja do fazy wodnej (o pH 5-7,5).

Permeacja - przenikanie substancji przez ciekłe membrany (emulsyjna lub unieruchomiona):
-adsorpcja cząsteczek na zewnętrznej stronie membrany,
-rozpuszczanie powierzchniowe zaadsorbowanych cząsteczek i ich dyfuzja poprzez materiał membrany,
-desorpcja lub odparowanie cząsteczek z drugiej strony membrany do medium odbierającego (roztwór pochłaniający).

Filtracja membranowa - siła napędową jest różnica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach membrany, przez którą przepływa rozpuszczalnik z roztworu bardziej stężonego do rozcieńczonego, stosowane do zagęszczania krwi, żelatyny, skrobi i enzymów:
-mikrofiltracja (>0,6 µm) - klarowanie wstępne, oczyszczanie i usuwanie bakterii,
-ultrafiltracja (0,1-001 µm) - usuwanie makromolekuł, bakterii i wirusów,
-nanofiltracja (0,01-001 µm) - usuwanie jonów jednowartościowych oraz mały cząsteczek organicznych,
-odwrócona osmoza (<0,001µm) - odsalanie wody i otrzymanie wody o wysokiej czystości.

Elektrodializa - siłą napędową jest różnica potencjału elektrycznego po obu stronach membrany, przez która transportowane są jony z roztworu o stężeniu mniejszym do roztworu o stężeniu większym

Precypitacja - wydzielania białek i cukrów, usuwanie zanieczyszczeń przy użyciu wysalania (siarczanu amonu), rozpuszczalnika (etanol, aceton), flokulacji, temperatury lub zmiany pH.

Oczyszczania produktów:

Metody chromatograficzne polegają na wykorzystaniu selektywnej sorpcji cząsteczek na odpowiednich materiałach i następującej desorpcji wydzielonej frakcji.

Typy procesów:

Chromatografia jonowymienna - wykorzystuje różnice w ładunkach elektrycznych, stosuje się wymieniacze jonowe:
-anionity np. dietyloaminoetylocelulozie (DEAE-celuloza),
-kationity np. karboksymetylocelulozie (CM-celuloza).

Chromatografia sorpcyjna- wykorzystuje różnice powinowactwa różnych związków do powierzchni aktywnego sorbentu ( sylikażel, tlenek glinu, węgiel aktywny)

Chromatografia powinowactwa - wykorzystuje specyficzne połączenia, które mogą tworzy się pomiędzy cząsteczkami enzymów a ligandami znajdującymi się w matrycy wypełnienia.

Chromatografia hydrofobowa- wykorzystywana jest do rozdzielenia związków o różnej hydrofilowości. Nośniki zawierają grupy hydrofobowe. Wiele enzymów i innych białek ma obszary hydrofobowe, które mogą być przyłączone do nośnika.

Chromatografia kowalencyjna- polega na wykorzystaniu odwracalnych wiązań kowalencyjnych między rozdzielanymi cząsteczkami a grupami funkcyjnymi osadzonymi w nośniku. Technika ta stosowana jest na przykład do wydzielania białek zawierających grupy SH za pomocą nośników zawierających grupy siarczkowe.

Filtracja żelowa- jest specyficzną technika zbliżoną do metod chromatograficznych, jednakże podstawowy mechanizm separacji polega na różnicy szybkości transportu w żelu cząsteczek o różnych rozmiarach. Filtracja żelowa jest wykorzystywana również do odsalania roztworów enzymów.

Tworzenie produktu:

Krystalizacja - jest stosowana do oczyszczania związków o małej masie cząsteczkowej, takich jak kwasy organiczne, aminokwasy, antybiotyki.

Np. Penicylina G jest krystalizowana z alkoholu, w wyniku dodania octanu potasu, enzymy o wysokiej czystości są również otrzymywane w formie krystalicznej.

Suszenie (do 10% wody) - uzyskiwanie stabilnej formy bioproduktu (łatwy transport i przechowywanie):
-suszenie próżniowe - biopreparat jest suszony w obniżonym ciśnieniu, w temperaturze pokojowej
-suszenie rozpyłowe - rozpylony biopreparat jest suszony w strumieniu gorącej pary (150˚C)
-liofilizacja- to specyficzna technika suszenia, wykorzystująca sublimację pary wodnej znad powierzchni zamrożonych produktów. Proces jest prowadzony pod bardzo niskim ciśnieniem.

Metody oczyszczania substancji biologicznych:

W praktyce, oczyszczenie preparatu od precypitantu polega na odsoleniu roztworu. Stosuje się głównie
techniki membranowe.

- Diafiltracja polega na zastosowaniu układu ultrafiltracyjnego z cyrkulacją roztworu oczyszczanego i sorfym uzupełnianiu tego roztworu czystą wodą. Siłą napędową procesu jest ftónica ciśnień.

- Dializa polega na wykorzystaniu przegród półprzepuszczalnych i przebiega pod wpływem różnicy stężeń między roztworem oczyszczanym a czystym rozpuszczalnikiem. Zanieczyszczenia drobnocząsteczkowe, np. sole, przenikają przez błonę do czystej wody.

-Elektrodializa polega na wykorzystaniu ruchu jonów w polu elektrycznym i przegród przepuszczalnych dla cząsteczek o określonym ładunku.

4. ROZWÓJ HISTORYCZNY BIOTECHNOLOGII:

Biotechnologia - integracja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu zastosowania organizmów, komórek i ich części oraz molekularnych analogów do pozyskania dóbr i usług. Rozwój biotechnologii obserwuje się głównie w trzech dziedzinach:
-rolnictwie i przetwórstwie rolno spożywczym,
-ochronie środowiska
-farmacji i medy­cynie.

Przy czym każda z nich jest nierozerwalnie połączona z przemysłem chemicznym.

Biotechnologia tradycyjna - użycie enzymów, drobnoustrojów i komórek organizmów wyższych, bez obcego materiału genetycznego.

Biotechnologia nowoczesna - użycie szczepów drobnoustrojów, linii komórkowych skonstruowanych metodami inżynieryjnymi.

W dziejach biotechnologii można wyodrębnić kilka etapów:

1.etap przedprzemysłowy- intuicyjny, rzemieślniczy

2. etap uprzemysławiania

3.etap przemysłowy

4. etap naukowy

1. Okres rzemieślniczy (do połowy XIX w.) - era spontanicznych procesów fermentacyjnych wykorzystywanych do otrzymywania produktów żywnościowych.

Kalendarium:
-3000 p.n.e. - produkcja chleba z zakwasu oraz wyrobów alkoholowych przez fermentację owoców,
-2000 p.n.e. - produkcja wina gronowego (Asyria),
-300 p.n.e. - produkcja piwa (Sumeria, Babilon, Egipt),
-XIV w. - produkcja octu (Francja) - na wiórach bukowych (prapoczątek unieruchomiania komórek).

Techniki stosowane w procesach technologicznych:
-zbiorniki drewniane,
-procesy okresowe, brak apa­ratury kontrolnej,
-naturalne kultury mikroorganizmów.

Robert Hooke (1635-1703) - opisał komórki (dębu korkowego).

Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) - skonstruował mikroskop (x270) i obserwował erytrocyty, bakterie oraz plemniki.

2. Okres uprzemysławiania (do lat 40. XX w.). - pozna­wanie w sposób naukowy biologicznej i chemicznej natury bioprocesów, zapoczątkowane przez L. Pasteura. Rozwój nowych koncepcji, biotechnologii i bioproduktów, np. produkcja kwasu mlekowego, cytrynowego, acetonu i butanolu, preparatów enzymatycznych, otrzymywanie drożdży. Zapoczątkowano stosowanie czystych kultur drobnoustrojów oraz prowadzenie bioprocesów w warunkach aseptycznych.

Kalendarium:
-1857 - opis fermentacji mlekowej (Pasteur),
-1881 - mikrobiologiczna produkcja kwasu mlekowego,
-1881 - szczepionka przeciwko wściekliźnie (Pasteur),
-1913 - wytwarzanie acetonu i butanolu (Wlk. Brytania),
-1916 - fermentacja acetonowo-butanolowa (C. Weizmann),
-1920 - produkcja kwasu cytrynowego metodą powierzchniową,
-1921 - szczepionka przeciwko gruźlicy (Calmette, Guerin),

Techniki stosowane w procesach technologicznych:
-zbiorniki stalowe, napowietrzanie i mieszanie mechaniczne,
-procesy okresowe oraz ciągłe, prosta aparatura kontrolna,
-czyste kultury mikroorganizmów.

Edward Jenner (1749-1823) - wprowadził prewencyjne szczepienie przeciwko ospie.

Appert Nicolas François (1750-1841) - wprowadził technikę konserwacji żywności w zamkniętych hermetycznie naczyniach, polegająca na długotrwałym gotowaniu (apertyzacja). Wprowadził uzyskiwanie żelatyny z kości.

Jonh Tyndall (1820-1893) - wykazał istnienie przetrwalników i zaproponował metodę kilkukrotnego wyjaławiania (tyndalizacja).

Ludwik Pasteur (1822-1895) - wykazał, że drożdże wywołują fermentację (udoskonalił techniki winiarskie), dowiódł, że mikroorganiz­my są czynnikiem etiologii wielu chorób zakaźnych, stworzył podstawy immu­nologii (szczepionki z atenuowanych szczepów cholery, wąglika i wścieklizny) oraz opracował metodę częściowego wyjaławiania w temp. 50-60°C (paste­ryzacja).

3. Okres przemysłowy (od roku 1945) - opracowanie przemysłowej produkcji penicyliny metodą tlenowej hodowli wgłębnej prowadzonej w warunkach aseptycznych w bioreaktorach o pojemności kilkudziesięciu m³.
   -Podokres 1 (do roku 1970) - integracja dyscyplin biologicznych, chemicznych, inżynieryjnych i opracowanie nowych technologii, np. biosyntezy antybiotyków, aminokwasów i biotransformacji steroidów oraz zastosowanie unieruchomionych biokatalizatory.
   -Podokres 2 (od roku 1970) - praktyczne wykorzystanie genetyki i biologii molekularnej w biotechnologii. Nastąpił rozwój metod rekombinacji DNA in vitro i in vivo. Opracowano szereg nowych biotechnologii, np. mikrobiologiczną produkcję insuliny, hormonów wzrostu, interferonów, białek odpornościowych, oraz technologię wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.

Kalendarium:
-1929 - odkrycie penicyliny (Fleming),
-1941 - przemysłowa produkcja penicyliny,
-1949 - produkcja kwasu octowego w hodowli wgłębnej,
-1949 - mikrobiologiczna produkcja witaminy B₁₂,
-1953 - mikrobiologiczna produkcja dekstranu (Gronwall, Ingelman),
-1955 - produkcja kwasu cytrynowego w hodowli wgłębnej.

Techniki stosowane w procesach technologicznych:
-bioreaktory ciśnieniowe, wieżowe, strumieniowe, mieszanie mechaniczne i napowietrzanie dużych zbiorników,
-procesy półokresowe i ciągłe, komputeryzacja sterowania bioreaktorami,
-techniki selekcjonowanie szczepów (mutacje) oraz unieruchomiania enzymów i komórek.

4. Okres naukowy

Na tym etapie, główną siła napędową rozwoju biotechnologii są badania naukowe, ukierunkowane przede wszystkim na modyfikację materiału biologi­cznego. Mają one decydujące znaczenie przy rozwoju nowych metod wytwa­rzania i produktów. Za najważniejsze dla tego etapu należy uznać prace JD. Watsona oraz F.H.C. Cricka. którzy w 1953 r. rozszyfrowali strukturę kwasu dezoksyrybonukleinowego DNA — podstawowego nośnika kodu gene­tycznego. Otrzymali za to nagrodę Nobla w 1962 r. Zrozumienie mechanizmu replikacji materiału biologicznego umożliwiło aktywne kształtowanie własnoś­ci drobnoustrojów. Początki prawdziwej inżynierii genetycznej to doświadczenie Paula Berga z uniwersytetu standfordzkiego z 1970 r. z manipulowaniem DNA (nagroda Nobla w 1980 r.).

Techniki stosowane w procesach technologicznych:

- zastosowanie technik inżynierii genetycznej do otrzymywania szczepów produkcyjnych.

- biologiczne wytwarzanie składników „obcych" dla danego mikroorganizmu, np.

insulina, interferon, czyli sztuczne kreowanie przemian biologicznych.

Następuje oczywiście dalszy rozwój konstrukcji aparatury i technik produkcyjnych. Ma to szczególne znaczenie w nowych działach biotechnologii w wytwarzaniu metodami biotechnologicznymi nowych produktów, zwłaszcza o dużym znaczeniu dla medycyny.

Johann Friedrich Miescher - odkrycie DNA (1869).

Francis Crick, James Watson,Rosalind Franklin - opis struktury DNA (1953).

Paul Berg - opis rekombinacji DNA (1970)

Inżynieria genetyczna jest uważana za podstawowe narzędzie w rozwiązaniu zasadniczych problemów współczesnego świata.

Inżynieria genetyczna - ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Polega ona na wprowadzaniu do komórek organizmu, którego cechy chcemy zmienić (biorcy), określonego odcinka DNA innego organizmu (dawcy).

Inżynieria genetyczna polega na:

-izolowaniu fragmentów materiału genetycznego z komórki,

-wprowadzeniu zmian do informacji genetycznej,

-przenoszeniu fragmentów DNA do komórek innego organizmu,

-powielaniu (klonowaniu) genów i całych organizmów.

Zakres zastosowań współczesnych biotechnologii: (perspektywy zastosowań inżynierii genetycznej)

Produkcja żywności:
-tradycyjne procesy fermentacyjne - produkcja pieczywa, produktów mle­cznych i roślinnych, drożdży, napojów alkoholowych,
-nowe technologie mikrobiologiczne - produkcja białka jednokomórkowców (SCP), amino­kwasów, witamin, nukleotydów, kwasów organicznych i polisacharydów,
-utrwalanie żywności - produkcja oksydaza glukozowej (antyutleniacz) oraz nizyny (konserwant),
-produkcja pasz - preparaty białkowe, witaminowe, aminokwasowe, antybiotyczne, stymulatory wzrostu, kiszonki roślinne,
-ochrona roślin - antybiotyki, bioinsektecydy, biopestycydy,
-lecznictwo zwierząt - antybiotyki, szczepionki.

Ochrona zdrowia:
-produkcja szczepionek i przeciwciał (testy immunologiczne),
-biosynteza antybiotyków, ami­nokwasów, kwasów organicznych, witamin, enzymów, inhibitorów enzymów, dekstranu, alka­loidów,
-biosynteza hormonów peptydowych, antygenów, leków steroidowych, witaminy C, glukonianu wapnia, efedryny.

Przemysł chemiczny:
-wytwarzanie surowców - alkohole, kwasy organiczne, polimery (dekstran, ksantan, pululan, kwas poli-β-hydroksymasłowy),
-produkcja nośników energii (biopaliwa) - etanol, metan, potencjalnie wodór,
-obróbka surowców naturalnych - hydroliza skrobi w trakcie wytwarzania tkanin, wytrawianie skór, fermentacja tytoniu,
-biohydrometalurgia - ługowanie rud, biozatężanie, odzyskiwanie metali,
-bioelektronika - bioczipy.

Ochrona środowiska:
-oczyszczanie ścieków - złoża zraszane, filtry biologiczne, osad czynny,
-bioutylizacja odpadów - namnażanie biomasy, procesy biosyntezy mikrobiologicznej, produkcja biogazu.

Analiza:
-zastosowanie enzymów rozpuszczalnych, np. oksydazy glukozowej (z katalazą lub peroksydazą) lub dehydrogenazy
glukozo-6-fosforanowej (z heksokinazą),
-czujniki enzymowe i komórkowe - oksydaza glukozowa + elektroda tlenowa, ureaza + elektroda pH,
-analiza genomów - analiza restrykcyjna, sekwencjonowanie, sondy molekularne.

Charakterystyka technologii biotechnologicznej:

- W procesach biotechnologicznych wykorzystywane są surowce odnawiane. Głównymi surowcami wykorzystywanymi w technologiach biochemicznych są węglowodany: skrobia i sacharoza oraz uboczne produkty przemysłu rolno-spożywczego. np. serwatka, melasa. Coraz większym zainteresowa­niem cieszy się wykorzystanie surowców celulozowych.
- Mikroorganizmy i enzymy przejawiają nieosiągalną w klasycznych proce­sach chemicznych wydajność i selektywność.
- Hodowle przeprowadzane są w bardzo umiarkowanych warunkach. Tempe­ratury zbliżone są do temperatury otoczenia. Nie stosuje się wysokich ciśnień.

- Procesy biochemiczne są energooszczędne.

Biotechnologia a mikrobiologia inżynieria:

Inżynieria cytogenetyczna- czyli inżynieria na poziomie komórkowym. Równolegle do rozwoju technik rekombinowania DNA in vitro, rozwijana jest technika fuzji komórek pozwalająca na rekombinację genetyczną in vivo w takim zakresie i z taką częstością, jakie w naturze są niemożliwe. Jej praktyczne wykorzystanie w biotechnologii przyniosło wiele wymiernych efektów.

Fuzja protoplastów stosowana jest, jako metoda doskonalenia właściwości biosyntetycznych szczepów i linii komórkowych.

Fuzja nowotworowych komórek szpiczaka z immunizowanymi komórkami produkującymi przeciwciała pozwala na otrzymanie linii komórek mieszańców.

Problemy bio bezpieczeństwa w biotechnologii:

Potencjalne zagrożenia wynikające z rozwoju biotechnologii są przedmiotem wielu obaw. Zagrożenia te są natury:

-molekularnej i wynikają

ze złożoności materiału biologicznego,

z możliwości wzbudzenia mutacji niekontrolowanych przez zabiegi inżynierii genetycznej,

z niejednoznaczności informacji genetycznej;

- zdrowotnej i wiążą się z możliwością wystąpienia

alergenów,

toksyn.

5. METODY IZOLACJI DROBNOUSTROJÓW O ZNACZENIU BIOTECHNOLOGICZNYM.

METODY DOSKONALENIA SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH.

METODY PRZECHOWYWYANIA SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH.

1. Izolacja szczepów przemysłowych:

Bardzo ważnym etapem rozwoju każdego procesu biotechnologicznego jest pozyskiwanie szczepu mikroorganizmu zdolnego do przeprowadzenia określonej reakcji lub wytworzenia określonego produktu.

Źródła pozyskiwania drobnoustrojów:

Istnieją 2 źródła pozyskiwania mikroorganizmów:

- szczepy muzealne- czyste kultury

Mogą służyć materiałem wyjściowym do przekształcania i udoskonalania szczepów. Kolekcje kultur zawierają ograniczony zasób mikroflory, zaś w naturalnym środowisku może istnieć szczep o znacznie lepszych własnościach technologicznych niż przechowywanie w kolekcjach.

W Polsce istnieje wiele kolekcji czystych kultur, o różnym zakresie i wielkości. Do najważniejszych z punktu widzenia technologii biochemicznej należą kolekcja INSTYTUTU BIOTECHNOLOGII ROLNO- SPOZYWCZEGO W WARSZAWIE, kolekcja WYDZAIŁU CHEMII I TECHNOLOGII ŻYWNOŚCI POLITECHNIKI ŁÓDZKIEJ oraz kolekcja AKADEMII TECHNICZNO-EKONOMICZNEJ WE WROCŁAWIU.

-szczepy autochtoniczne- ze środowiska naturalnego; szczepy ze środowiska naturalnego są lepsze, ponieważ szczepy muzealne po pewnym czasie mogą traci właściwości. Bakterie uzyskiwane ze środowiska są najbardziej aktywne.

Środowisko naturalne jest niewyczerpanym źródłem mikroorganizmów. Pewna cześć z nich, może, zwłaszcza po udoskonaleniu, Mie znaczenie przemysłowe. Izolowanie takich organizmów jest swoista sztuką. Wymaga często przeprowadzeniu wielu pracochłonnych badań.

Poszukiwanie drobnoustrojów w środowisku naturalnym obejmuje następujące etapy: wybór miejsca i pobranie próbek mikroorganizmów, wstępną obróbkę próbek, namnażanie drobnoustrojów i selekcję czystych kultur, testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do określonego procesu technologicznego.

Pozyskiwanie szczepów o znaczeniu technologicznym, zwane często SKRININGIEM, obejmuje cały zespół zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby możliwych drobnoustrojów tych, które odpowiadają stawianym wymaganiom technologicznym.

Kryteria wyboru mikroorganizmu dla danego procesu technologicznego:

Odżywianie - najlepiej substancje odpadowe (metanol, melasa, serwatka, ług posiarczynowy).

Temperatura - najlepiej 30-40˚C (wyższa temperatura stwarza problem chłodzenia, ale zmniejsza ryzyko zakażenie).

Adaptacja - zdolność mikroorganizmu do wzrostu w aparaturze przemysłowej.

Stabilność cech drobnoustrojów i odporność na manipulacje genetyczne.

Produkcyjność - zdolność przetwarzania substratu w produkt z wysoką wydajnością, liczona w jednostce czasu.

Łatwość wydzielenia produktu.

Brak toksycznych produktów metabolizmu (z wyjątkiem produkcji surowic i szczepionek).

2. Metody otrzymywania szczepów o pożądanej charakterystyce:

Techniki izolacyjne polegają na takim prowadzeniu namnażania szczepów mikroorganizmów, które faworyzowałyby drobnoustroje o pożądanych właściwościach. Podstawową metodą jest przeglądanie grup mikroorganizmów, mogące wykazać pożądane własności i sprawdzanie czy dane cechy występują i w jakim stężeniu.

Techniki te nie dają gwarancji absolutnej selektywności. Pozwalają za to uzyskać zmiany proporcji ilościowych w wyjściowej populacji mieszanej, dzięki czemu łatwe jest wyizolowanie czystych kultur poszukiwanych drobnoustrojów.

3. Ulepszenie szczepów przemysłowych:

Doskonalenie szczepów przemysłowych:

Szczepy mikroorganizmów pochodzenia naturalnego zwykle wytwarzają produkty o znaczeniu przemysłowym w niewielkich ilościach. Opracowano więc wiele procedur mających na celu zwiększenie produkcyjności tych organizmów. Najważniejsze z nich to:

Optymalizacja składu podłoża.

Optymalizacja warunków hodowli.

Mutageneza - związana z dwustopniową procedurą (wywołanie mutacji oraz selekcja i ocena mutantów):
-fizyczna (promieniowanie UV, λ = 254-265 nm,15 W, 20 cm, 2-3 min.),
-chemiczna (etylenoimina, kwas azotawy, dimetylonitrozoamina).

Techniki wywołania mutacji:

Techniki modyfikacji genetycznej są powszechnie stosowane, gdyż dają największe możliwości zwiększania produkcyjności. Polegają one na wywoływaniu mutacji i sprawdzaniu ich skutków.

-promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie X, gamma.

-mutageny fizyczne: kwas azotawy, związki alkalizujące,
np. N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG - rys. 3.2)

Najbardziej jest rozpowszechnione stosowanie promieniowania ultrafioleto­wego
o długości fali 254-265 nm (daleki ultrafiolet). Jest to z jednej strony najbardziej zabójcze promieniowanie i jednocześnie najbardziej mutagenne.

Zalety tej metody to:

-dostępność i łatwość użycia,

-łatwość dozowania dawek,

-powtarzalność warunków mutagenizacji,

-wysoka częstotliwość powstawania mutacji,

-możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów,

-wywoływanie mutacji zarówno w komórkach wegetatywnych, jak również w komórkach spoczynkowych, np. w sporach.

Selekcja mutantów - zespół technik, które mają zapewnić szybką i efektywną ocenę efektów mutagenezy i wyodrębnienie ewentualnych komórek o pożądanych cechach:

Wskaźniki chemiczne:
-wskaźniki pH - oznaczanie kwasów lub zasad,
-wskaźnik z jodyną - oznaczanie skrobi i ocena aktywności amylolitycznych,
-wskaźnik czerwień kongo - oznaczanie celulozy i ocena aktywności celulolitycznych,
-podłoże żelatynowe - ocena aktywności proteolitycznych.

Wskaźniki mikrobiologiczne:
-metoda tworzenia replik za pomocą welwetowego stempla - kolonie wyrosłe na replikach są stosowane do testowania, zaś wyjściowa płytka służy do izolacji wybra­nych kolonii,
-metoda krążków agarowych - wycięte jałowo krążki podłoża inkubuje się i przenosi na płytki z drobno­ustrojem testowym. Wokół kolonii drobnoustrojów produkujących antybio­tyki nie będą rozwijały się drobnoustroje testowe. Wokół kolonii produkującej aminokwasy będą się rozwijały organizmy testowe wymagające danego aminokwasu.

Adaptacja mikroorganizmów:

W pracach nad udoskonalaniem producentów określonych metabolitów często stosowane są różnorodne techniki adaptacji.

Adaptacja- zmiana w celu przystosowania do nowych warunków

Modyfikacja organizmu, tak, aby kluczowy enzym kontrolujący drogę asymilacji był wydzielany poza komórkę:
-regulacja przepuszczalności błony komórkowej poprzez kontrolę stężenia biotyny (produkcja aminokwasów)

Modyfikacja organizmu, tak, aby nie wytwarzał końcowego produktu kontrolującego drogę asymilacji.

Modyfikacja organizmu, tak, aby nie rozpoznawał obecności inhibitora lub represor:
-w wyniku selekcji można znaleźć mutanty odporne na analog danego metabolitu, w efekcie dając nadprodukcję danego metabolitu

Przykłady:

- Dla bakterii produkujących kwas glutaminowy można modyfikować przepuszczalność ścian komórkowych przez kontrolę stężenia biotyny w roz­tworze. Przy niskich stężeniach biotyny bakterie (Corynebacterium glutamicum) wydzielają kwas glutaminowy, zaś przy stężeniu biotyny optymal­nym dla wzrostu, bakterie te wytwarzają kwas mlekowy.

- Często stosowana jest następująca technika służąca selekcji auksotrofów: hoduje się mikroorganizmy w pożywce minimalnej i dodaje antybiotyk, np. penicylinę, który działa wyłącznie na formy wegetatywne.

- Można w wyniku selekcji znaleźć mutanty odporne na analog danego metabolitu, co w rezultacie daje nadprodukcję danego metabolitu (np. aminokwasu).

4. Przechowywanie szczepów przemysłowych:

Zapewnienie czystości mikrobiologicznej i genetycznej szczepów produkcyjnych jest podstawowym warunkiem prowadzenia powtarzalnych procesów biotechnologicznych.

Podstawową zasadą jest ograniczenie pasażowania, gdyż stwarza ono możliwośc pojawienia się niepożądanych mutacji spontanicznych. Długotrwałemu przechowywaniu sprzyja maksymalne zahamowanie procesów metabolicznych w przechowywanych komórkach.

Metody przechowywania szczepów:

Najpowszechniejszymi metodami jest metoda przechowywania w formie bezwodnej oraz przechowywania w obniżonej temperaturze:

-Metoda przechowywania w formie bezwodnej stosuje się dla drobnoustrojów zarodnikujących i przetrwalnikujacych - najbardziej korzystnymi formami do przechowywania są spory z l-2-tygodniowej hodowli, oraz dla drobnoustrojów niewytwarzających spór.

- Przechowywanie mikroorganizmów w obniżonej temperaturze stanowi powszechnie stosowaną technikę. Okres przechowywania i zakres zastosowa­nia zależy od temperatury przechowywania, podłoża i formy fizjologicznej drobnoustroju. Szczepy mikroorganizmów na skosach agarowych przechowuje się w tem­peraturze -20°C lub -5°C, do 6 miesięcy. Efektywnym, ale bardzo drogim sposobem przechowywania jest utrzymy­wanie próbek w mieszaninach wymrażających lub ciekłym azocie (w tempera­turze -I96°C). Komórki przed zamrożeniem umieszczane są w specjalnym roztworze krioochronnym, może nim być 10% roztwór glicerolu. Okres prze­chowywania w ciekłym azocie wynosi do kilku miesięcy.

6. METODY PROWADZENIA PROCESÓW BIOTECHNOLOGICZNYCH:

Klasyfikacja technik hodowlanych:

Hodowle mikroorganizmów można podzielic, z uwagi na stan fizyczny pożywki, na dwie zasadnicze grupy: HODOWLE W PODŁOŻACH CIEKŁYCH - HPC oraz HODOWLE W PODŁOŻACH STAŁYCH - HPS

HODOWLE W PODŁOŻACH CIEKŁYCH - HPC

Obejmują mikroorganizmy znajdujące się w postaci zawiesiny pojedynczych komórek lub ich aglomeratów w ciekłej pożywce ( hodowle wgłębne) i przypadek wzrostu grzybów strzępkowych w postaci „ kożucha” na powierzchni ciekłej pożywki( hodowle powierzchniowe)

HODOWLE W PODŁOŻACH STAŁYCH - HPS

Stosowane są do hodowli grzybów mikroskopowych. Organizmy te rosną w stałych podłożach takich jak np. ziarna zbóż, otręby pszenne, odpady celulozowe. Podłoże stałe misi mieć odpowiednią wilgotność.

Np. dla wzrostu grzybów Aspergillus niger na ryżu lub otrębach pszennych wilgotność podłoża wynosi ok. 50-60%.

Podstawowymi zaletami hodowli w podłożach stałych są:

-prostota aparatury,

-możliwość uzyskiwania wyższych stężeń produktów,

-uzyskiwanie wysokich wydajności wytwarzania metabolitów dzięki wzros­towi grzybów w warunkach zbliżonych do naturalnych,

-wykorzystywanie surowców odpadowych.

Hodowle w podłożach stałych są wykorzystywane głównie do produkcji preparatów enzymatycznych.

Podział technik hodowlanych na sposób prowadzenia procesu:

Hodowla okresowa - są prowadzone w systemach zamkniętych. Mikroorganizmy wzrastają zgodnie z fazami wzrostu (adaptacji, przysposobienia, wykładnicza, hamowania, stacjonarna, liza komórek). Stężenie substratów równomiernie spada. W czasie wzrostu lub po jego zakończeniu powstaje określony produkt, który jest izolowany z całości hodowli, z komórek lub z przesączu pohodowlanego. Następnie aparatura jest przygotowywana do kolejnego cyklu produkcyjnego (produkcja biomasy):
+ łatwość utrzymywania warunków jałowych,
+ prostota prowadzenia procesu,
+ odnawialność inokulum zapobiegająca degeneracji szczepu (stabilność cech),
+ łatwo zauważalna infekcja,
+ izolacja danego metabolitu w danej fazie wzrostu (pierwotnego w fazie wykładniczego wzrostu, wtórnego w fazie stacjonarnej),
- mała wydajność,
- brak możliwości regulacji stężenia substratów

Hodowla półokresowa - polegają na wprowadzaniu do hodowli pod koniec fazy wzrostu wykładniczego lub po jej zakończeniu, świeżej pożywki (zmienna objętość) oraz okresowe odbieranie części hodowli i izolacja produktu (produkcja drożdży piekarniczych, antybiotyków, aminokwasów, alkoholu):
+ duża elastyczność i optymalizacja procesu,
+ możliwość kontrolowania stężenia substratu,
+ możliwość automatyzacji procesu,
- konieczność jałowego dozowania pożywki,
- niebezpieczeństwo degeneracji szczepu w hodowlach wielokrotnych.

Hodowla ciągła - polegają na tym, że po wstępnym okresie namnażania mikroorganizmów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli strumieniem świeżego podłoża, połączone z jej ciągłym odbiorem, przy zachowaniu stałej objętości (produkcja białka paszowego, fermentacja alkoholowa, mleczanowi, octowa, oczyszczanie ścieków):
+ możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podłoża,
+ możliwość automatyzacji procesu,
+ większa szybkość i wydajność wielu procesów (uzyskiwanie większych stężeń),
- degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji,
- trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas,
- rozwój mikroorganizmów, tworzących układy wielokomórkowe w postaci kłaczków i kuleczek

Metody unieruchamiania materiałów biologicznych:

Znanych jest wiele technik unieruchomiania komórek.

Wszystkie one mu­szą spełniać kilka podstawowych wymagań:

- Muszą być bezpieczne.

- Muszą być proste.

- Muszą zapewniać długotrwałe użytkowanie.

- Muszą zapewniać wysoką aktywność materiału biologicznego.

- Muszą być tanie

T

echniki unieruchamiania komórek i enzymów można podzielić na:

-Metody sorpcyjne polegają na związaniu komórek lub enzymów na powierzchni materiału stałego. Należą one do najprostszych technik unieru­chomiania. Stosuje się różnorodne, tanie materiały, jak np. szkło porowate, węgiel drzewny, wióry drewniane, tlenek glinu, sylikażel, pochodne celulozy. Wadą metod sorpcyjnych jest możliwość desorpcji materia­łu biologicznego z powierzchni nośnika.

- Metody zamykania w siatce polimeru są równie popularne jak metody sorpcyjne. Polegają one na unieruchomianiu komórek lub enzymów wewnątrz naturalnych lub syntetycznych żeli. Najczęściej stosuje się alginiany, karaganiany, agar i żel poliakrylamidowy. Stosowanie naturalnych polisacharydów ma wiele zalet. Są to materiały tanie i bezpieczne.

-Metody agregacji mniejsze cząsteczki enzymów łączą się ze sobą w większe agregaty, dzięki czemu mają możliwość działania na większe cząsteczki.

Wyodrębnioną grupą technik jest zamykanie materiału biologicznego wewnątrz półprzepuszczalnych membran. Najczęściej stosuje się membrany z octanu celulozy lub kolagenowe.

Procesy z unieruchomionym materiałem biologicznym:

Bioreaktory z unieruchomionym materiałem biologicznym stosowane są w trzech głównych grupach procesów technologicznych:
- Biokonwersja. Reaktory do prowadzenia biokonwersji wykorzystują unieru­chomione enzymy, unieruchomione nieaktywne komórki lub komórki akty­wne, lecz nierosnące. Zwykle w reaktorach tych nie występuje napowie­trzanie, nie jest też wydzielany dwutlenek węgla.
- Wytwarzanie metabolitów niezwiązanych ze wzrostem. Procesy te czasami wymagają doprowadzenia tlenu, wydzielany jest dwutlenek węgla. Unieruchomianie są aktywne komórki bądź w fazie stacjonarnej, bądź rosnące na powierzchni lub wewnątrz nośnika.
- Wytwarzanie metabolitów pierwotnych. Komórki muszą być tak unierucho­mione, aby możliwy był normalny metabolizm substratu. Często wymagane jest dobre napowietrzanie.

Unieruchomiony materiał biologiczny może być wykorzystany w różnego typu fermentorach. Najczęściej stosowane są reaktory z nieruchomym złożem lub ze złożem cyrkulującym. Stosowane sa też aparaty fluidalne typu ciecz-ciecz stałe lub trójfazowe gaz-ciecz- ciało stałe.

Biotransformacja - jedno-, rzadziej dwuetapowe, chemiczne przekształcenie egzogennych związków w strukturalnie im podobne, dokonywane przez żywą komórkę. Produkty końcowe często nie mają znaczenia dla komórki, a niekiedy są wręcz toksyczne:
-biotransformacja nie jest celem działania komórki = to proces niezależny od funkcji jej życiowych.

Procesy biotechnologiczne ogólnie można podzielic na takie, w których pożądany produkt powstaje jako efekt złożonych przemian pierwotnego lub wtórnego metabolizmu oraz na takie, w których czynnik biologiczny stosowany jest do przeprowadzenia ściśle określonej przemiany chemicznej.

Materiał biologiczny wykazuje wiele cennych cech z punktu widzenia prowadzenia przemian chemicznych. Należą do nich:

Specyficzność:
-reakcyjna - enzym powoduje konkretną przemianę chemiczną,
-substratowa - enzym działa na konkretny substrat,
-stereochemiczna - enzym wytwarza produkty o konkretnej strukturze

W procesach biotransformacji stosowane są w różnych procesach technologicznych. W procesach biotransformacji stosowane są zarówno różne drobnoustroje, jak również komórki zwierzęce, komórki roślinne oraz pojedyncze enzymy lub kompleksy enzymów.

Techniki biotransformacji:

Używane są komórki rosnące, komórki w fazie stacjonarnej oraz spory. W wyniku przeprowadzanej przemiany uzyskuje się roztwory produktu, które przerabiane są podobnie jak inne produkty przemian biochemicznych.

Biotransformacje przez rosnące komórki - substrat mający podlegać transformacji dodawany jest w eksperymentalnie określonym momencie fazy wzrostu. Metoda jest bardzo prosta, często używa­na w badaniach i selekcji szczepów. Niska wydajność.

Biotransformacja przez komórki w fazie stacjonarnej - namnożone komórki odwirowywane są z medium wzrostowego i rozpra­szane w medium transformacyjnym, do którego dodawany jest substrat. Zaletami jest niezależność wzrostu i transformacji, brak efektów hamujących substratu lub produktu, możliwość regulacji stężenia biomasy, łatwiejsze oczyszczanie produktu biotransformacji.

Biotransformacja przez spory - zastosowanie spór, jako biokatalizatorów w transformacjach chemicznych ma wiele zalet, ze względu na ich stabilność, łatwość przechowywania i trans­portu. Dają one wysoką wydajność biotransformacji przy nieznacznym wytwa­rzaniu produktów ubocznych. Medium stosowane w tej technice jest proste (woda lub częściej roztwór buforowy), pienienie się roztworu jest nieznaczne, zaś wydzielenie produktów zwykle efektywne.

Biotransformacje przez unieruchomiony materiał biologiczny - unieruchamiać na lub w stałym nośniku można: komórki drobnoustrojów, komórki roślinne i zwierzęce, spory oraz enzymy. Najczęściej używaną techniką jest zamykanie komórek w żelach alginianowych, poliakryloamidowych. Umożliwia prowadzenie ciągłych procesów biotransformacji, np. penicyliny G.

Zastosowanie biotransformacji:

Wiele różnych reakcji chemicznych może byc przeprowadzonych za pomocą biotransformacji.

Należą do nich:

- utlenianie

-redukcja
- hydroliza

-specyficzne podstawienia grup funkcyjnych

W wielu dziedzinach przemysłu stosowane są różnego rodzaju preparaty enzymatyczne służące do przeprowadzenia biotransformacji.

Typy zastosowań:

Biotransformacje cukrów:
-hydroliza skrobi do maltozy (B. polymyxa),
-hydroliza sacharozy do glukozy i fruktozy (A. niger),
-hydroliza laktozy do glukozy i galaktozy (Kluyveromyces fragilis),
-izomeryzacja glukozy do fruktozy (B. coagulans).

Biotransformacje alkoholów:
-utlenianie etanolu do octanu (Acetobacter schuzenbachii, A. curvum)
-utlenianie D-sorbitolu do L-sorbozy w produkcji witaminy C (Gluconobacter suboxydans),
-utlenianie glicerolu do dihydroksyacetonu (Gluconobacter melanogenes).

Biotransformacje aminokwasów:
-kondensacja amoniaku z kwasem fumarowym, powstaje kwas L-asparaginowy (E. coli),
-kondensacja amoniaku z kwasem cynamonowym, powstaje L-fenyloalanina (Rhodotorula glutinis).

Biotransformacje antybiotyków:
-hydroliza penicyliny G do kwasu 6-aminopenicylanowego (B. megaterium, Proteus rettgeri),
-hydroliza penicyliny V do kwasu 6-aminopenicylanowego (Bovista plumbea),
-hydroliza cefalosporyny C do kwasu 7-aminocefalosporynowego (Pseudomonas putida).

Biotransformacje sterydów:
-hydroksylacja progesteronu w hydroksyprogesteron (Rhizopus nigricans),
-dehydrogenacja kortyzolu w prednizolon (B. lentus).

Bioreaktory:

Zwane również fermentorami, są urządzeniami służącymi do hodowli drobnoustrojów, komórek roślinnych i zwierzęcych. Do bioreaktorów zalicza się również reaktory enzymatyczne do prowadzenia przemian enzymatycznych- maja one wiele cech wspólnych z innymi bioreaktorami ale sa bardziej zbliżone do reaktorów chemicznych.

Podział bioreaktorów ze względu na sposób prowadzenia procesu:

Bioreaktory do hodowli wgłębnej.

Bioreaktory do hodowli wgłębnej:

Bioreaktory wykorzystywane do hodowli prowadzonych w roztworach pożywek można podzielić na:

- fermentory stosowane do hodowli beztlenowych

- fermentory stosowane do hodowli tlenowych

Fermentory stosowane do hodowli beztlenowych:

W procesach beztlenowych podstawowa funkcja bioreaktora polega na stworzeniu beztlenowego środowiska właściwego dla danej hodowli. Mieszanie płynu hodowlanego: -służy głównie do przeciwdziałania osadzaniu się zawiesin.

- Piana powstaje w wyniku wydzielenia się dwutlenku węgla. Brak napowietrzania i często brak mechanicznego mieszania płynu powodują, że powstanie piany, w odróżnieniu od hodowli tlenowych, nie jest istotnym problem technicznym.

- w browarnictwie stosowane są poziome kadzie fermentacyjne o kształcie graniastosłupa. W starszych biotechnologiach stosowane były zbiorniki otwarte. Obecnie są to aparaty zamknięte, wyposażone w układy chłodzenia.

Szczególne miejsce wśród fermentorów do hodowli beztlenowych zajmują aparaty do fermentacji metanowej. Wynika to z tego:

- w fermentacji metanowej przerabia się znaczne ilości substratu

- proces prowadzony jest w warunkach niejałowych

- czasy przebywania w reaktorze są bardzo duże - do kilkunastu dni

Fermentory stosowane do hodowli tlenowych:

Aparaty do hodowli tlenowych muszą mieć elementy umożliwiające doprowadzenie gazy i jego rozproszenie w fazie ciekłej. Niezbędne są także odpowiednie króćce umożliwiające doprowadzenie pożywki, zaszczepienie pożywki, pobieranie próbek, opróżnianie aparatu. Materiał, z którego wykonany jest fermentor musi być nietoksyczny, wytrzymały na sterylizację i odporny na korozje.

Fermentory do tlenowych hodowli wgłębnych można podzielić na:

- fermentory z mieszaniem mechanicznym

- fermentory z mieszaniem cieczą

- fermentory z mieszaniem gazem

Bioreaktory do hodowli w podłożu stałym:
-komory powierzchniowe (5-6 cm pożywki),
-komory wgłębne (50-100 cm), w tym bębnowe (1 obrót/1 min), np. namnażanie grzybów, biokompostowanie.

Hodowle w podłożu stałym prowadzone są prawie wyłącznie w aparatach o działaniu okresowym. Najprostszym aparatem służącym do hodowli w podłożu stałym jest komora inkubacyjna z tacami, na których ułożone jest zaszczepione podłoże.

Szczegółową techniką wykorzystywana w tych technologiach jest kompostowanie. Jest to powszechnie stosowana metoda utylizacji odpadów stałych. Najczęściej proces jest realizowany w stertach z napowietrzaniem naturalnym. Podejmowane są również próby wykorzystania wieżowych aparatów o działaniu ciągłym.

Bioreaktory z unieruchomionym materiałem biologicznym:
-fermentory z obrotowymi dyskami (mikroorganizmy rosną na dyskach, częściowe zanurzanie i wynurzanie),
-fermentory membranowe, półprzepuszczalne (oddzielenia produktu od substratu lub komórek zwierzęcych od roślinnych).

Wiele bioreaktorów działa w warunkach jałowych. Wymagania jałowości występują zwłaszcza w tych procesach, w których stosuje się czyste kultury drobnoustrojów. Szczepy produkcyjne wykazują wysoką wydajność wytwarzania określonych metabolitów; jednocześnie bardzo często są wrażliwe na infekcje „obcych” szczepów.

7. BIOTECHNOLOGICZNA PRODUKCJA BIOMASY DROBNOUSTROJÓW

MOŻLIWOSC BIOTECHNOLOGICZNEGO WYKORZYSTANIA PRODUKTÓW ODPADOWYCH

Biomasa:

Biomasa - jest to substancja organiczna, która znajduje się w komórkach roślin, zwierząt i bakterii, używana jako źródło białka.

Biomasa mikroorganizmów stosowana jako źródło protein często jest określana mianem „ białka jednokomórkowców- SCP.

- Przemysłowa produkcja drożdży piekarnianych datuje się od połowy IXI wieku, zaś przemysłowa produkcja biomasy mikroorganizmów dla celów spożywczych została uruchomiona w Niemczech w czasie I wojny światowej- była to hodowla drożdży pastewnych.

Ponownie zainteresowano się masową produkcją drożdży w latach 30-tych i podczas II wojny światowej. W Niemczech w okresie II wojny światowej produkowano ok. 15 tys. Ton rocznie drożdży, zużywanych następnie do wytwarzania zup i kiełbas.

- główną przyczyną zainteresowania produkcją biomasy mikroorganizmów jest światowy deficyt białek. Biomasa mikroorganizmów stanowi wartościową alternatywę w stosunku do tradycyjnych źródeł białek. Zmniejszenie zużycia soi, mączki rybnej i zbóż w spasaniu trzody i drobiu może zwiększyć podaż tych surowców spożywczych dla bezpośredniej konsumpcji przez ludzi.

Zalety przemysłowej produkcji białek w porównaniu z metodami tradycyjnymi.

Szybki przyrost biomasy porównaniu z roślinami (czas podwojenie masy):
-bakterie (1-7 h), glony (6-50 h), trawy (1-2 tygodnie), świnia (4-6 tygodni).

Wyższa zawartość białek (w suchej masie):
-mikroorganizmy: bakterie (75%), drożdże (50%), grzyby (30-50%),
-rośliny: mikroalgi (50-60%), ryż (10%), kukurydza (10%),
-mięso: wołowina (80-90%).

Szerszy wachlarz utylizowanych surowców (często odpadowych):
-metan, metanol, etanol (tańsze od melasy, do produkcji formaldehydu),
-cukry proste: pentozy (cukier drzewny, ług posiarczynowy), heksozy (cukier trzcinowy, buraczany, syrop celulozowy, skrobia),
-dwucukry (melasa, sok trzcinowy, buraczany, serwatka),
-parafiny (ropa - regres po latach 60, ze względu na koszta),
-wielocukry (zboża, ziemniaki, maniok, drewno, stoma, wy­tłoki trzciny cukrowej).

Wysoka wydajność i najmowanie małej przestrzeni przez instalacje produk­cyjne.

Niezależność od zmian pogody, klimatu oraz sezonowości.

Możliwość wzbogacania pożywienia w aminokwasy egzogenne (walina, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan, lizyna, metionina i treonina), które występują często w niedomiarze w produktach roślinnych.

Łatwe wydzielanie biomasy (bakterie - wirowanie, drożdże i grzyby - wirowanie, filtracja).

Substytut wobec mączki mięsno-kostnej (priony).

Surowce do produkcji biomasy:

Głównym surowcem dla produkcji biomasy jest substrat stanowiący źródło węgla. Surowiec ten jest zwykle zarówno źródłem węgla jak i energii. Koszty tego surowca wywierają decydujący wpływ na koszty produkcji. Surowce możemy podzielić na:

-proste surowce chemiczne ( metan, etanol, kwas octowy, parafiny)

- złożone surowce organiczne ( zwykle organiczne odpady z przemysłu spożywczego, rolnictwa)

Najczęściej jako źródło azotu używane są sole amonowe. Są one tanie i dostępne. Ponadto źródłem azotu mogą być: azotany oraz mocznik.

Wszystkie surowce węglowe wymagają tlenu dla efektywnego przeprowadzenia konwersji w biomasę. Stosuje się tlen z powietrza, jeśli wymagają tego warunki procesowe, stosuje się powietrze wzbogacone w tlen. Często wzrost mikroorganizmów w fermentorach jest limitowany szybkością natleniania hodowli.

C-1 metan gaz naturalny, węgiel kamienny, gazyfikacja drewna, proce

-sy dygestii

C-1 metanol gaz syntezowy (CO2 + H)

C-2 etanol ,kwas octowy etylen, fermentacja etanolowa

C-5 pentozy cukier drzewny, ług posiarczynowy

C-6 heksozy cukier trzcinowy, cukier buraczany, syrop glukozowy ,

Skrobia

C-2 dwusacharydy melasy, sok trzcinowy, sok buraczanym serwatka

C-10…C-23 parafiny ropa (gas-oil)

Polisacharydy: skrobia, celuloza zboża, ziemniaki, maniok, drewno, stoma, wytłoki trzciny

cukrowej

Charakterystyka produktu- biomasy mikroorganizmów:

Najczęściej biomasa mikroorganizmów jest wydzielana z płynu pohodowlanego przez filtrację lub wirowanie.

U bakterie stosuje się wirowanie, zaś u drożdży i grzybów mikroskopowych są wydzielane za pomocą filtracji.

Końcowe operacje z biomasą przed odpowiednim poziomie higieny, ale nie w warunkach sterylnych. Końcowy, suchy produkt powinien być bakteriologicznie stabilny. W zależności do użytego surowca, może być konieczna odpowiednia obróbka surowca w celu usunięcia niepożądanych składników.

Jeżeli biomasa mikroorganizmów ma być stosowana w żywieniu człowieka, wymagane jest jej przetworzenie w celu usunięcia kwasów nukleinowych.

Metody usuwania kwasów nukleinowych z biomasy mikroorganizmów:
-zawartość kwasów nukleinowych w SCB - 8-25 g/100 g białek,
-dzienna dawka kwasów nukleinowych dla człowieka - 2 g.

Hydroliza alkaliczna - metoda szybka, prosta, powoduje straty wartości odżywczych.

Ekstrakcja - szybka i prosta metoda, umożliwia usunięcie RNA, powoduje straty masy i azotu, konieczne jest usuwanie resztek rozpuszczalnika.

Hydroliza enzymatyczna - szybka i prosta metoda ale droga- kosztowna (drogie nukleazy)

Można wykorzystać enzymy endogenne: metoda polega zdezintegrowaniu komórek oraz inkubacji w obecności chlorku sodowego w celu aktywacji enzymów endogennych, Rnazy (dodatek 0,1% soli powoduje redukcję RNA o 75%), Czas inkubacja 15-20 min. Następnie doprowadza się do precypitacji białek w wyniku schłodzenia zawiesiny do temperatury poniżej 30 stopni lub przez zmianę pH poniżej 5 w wyniku dodania HCL. Uzyskany precypitat białkowy jest filtrowany, przemywany i suszony.

Hodowle mikroorganizmów na węglowodanach:

Głównymi mikroorganizmami do utylizacji węglowodanów są drożdże piekarniane- Saccharomyces cerevisiae bądź pastewne- Candida utilis. Mogą one rosnąc w warunkach tlenowych lub beztlenowych, jednak wydajność biomasy w procesie tlenowym jest znacznie większa.

W warunkach tlenowych drożdże wykazują tzw. Efekt Crabtree'ego, tzn. wytwarzają etanol przy stężeniach cukrów prostych przewyższających pewien poziom krytyczny.

Decydującą pozycją w kosztach produkcji drożdży jest koszt surowca. Dlatego hodowle prowadzi się przy niskich stężeniach cukrów, najczęściej metodą hodowli półciągłej lub ciągłej w celu uzyskania jak najwyższego stopnia przetworzenia substratu w biomasę.

HODOWLA DROŻDŻY PIEKARNIANYCH NA MELASIE:

Drożdże piekarniane należą do gatunku Saccharomyces cerevisiae. Są to odmiany pyliste, górnej fermentacji. Sa produktem rynkowym, stosowanym do wyrobu ciast. Odznaczać się muszą zdolnością do szybkiego spulchniania ciasta oraz odpowiednim smakiem i zapachem, który nie może ujemnie wpływać na smak i zapach wyrobów piekarnianych.

- do spulchniania ciast, już w XVII, wieku stosowano drożdże piwne, a dokładniej, osad drożdży zbierany z dna kadzi fermentacyjnej. Następnie zaczęto stosować osad drożdży z gorzelni.

- na skalę przemysłowa rozpoczęto produkcję drożdży w Wiedniu w 1850.

-w początkach XX wieku zastosowano do produkcji drożdży melasę, a następnie lepsze napowietrzanie oraz stopniowe dozowanie surowca.

Melasa- to produkt uboczny przemysłu cukrowego. Powstaje w cukrowniach przerabiających trzcinę cukrową, jak i podczas przetwórstwa buraków cukrowych.

Melasa jest cennym surowcem dla przemysłu biotechnologicznego. Z uwagi na cenę, stosowana jest ona do produkcji drożdży piekarnianych, kwasu cytrynowego oraz w gorzelniach przemysłowych. Melasa jest gęsta cieczą o barwie ciemnobrązowej i charakterystycznym zapachu. Najbardziej wartościowym składnikiem melasy jest sacharoza. Na zawartość sacharozy Duzy wpływ ma kwasowość melasy. Gdy pH melasy jest mniejsze niż 7, następuje kwaśna hydroliza sacharozy do glukozy i fruktozy. Dalszy rozkład tych cukrów prostych prowadzi do powstania kwasów organicznych i aldehydów, które szkodliwie oddziałują na drożdże.

Melasę przed hodowlę zakwasza się, przez dodanie kwasu siarkowego do pH 4, ogrzewa 120-125 stopni, dodaje składniki mineralne. Wytrącone osady oddzielone są bądź przez sedymentację bądź przez wirowanie.

Produkty uzyskane z melasy:

1. etanol - 2. drożdże Saccharomyces cerevisiae

1. drożdże piekarskie - 2. drożdze Saccharomyces cerevisiae

1. drożdze paszowe - 2. drożdze Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis

1. witamina B3 - 2. bakterie Bacillus sphericus

1. kwas cytrynowy - 2. pleśnie Aspergillus Niger

1. aceton - 2. bakterie Clostridurn acetobutylicum

1. dekstran - 2. bakterie Leuconostoc mesenteroides ssp. Dextranicum

HODOWLA DROŻDŻY PIEKARNIANYCH NA ŁUKU POSIARCZANOWYM:

W procesie produkcji papieru usuwa się z drewna ligninę i hemicelulozę. Jedna z metod polega na gotowaniu drewna w roztworze siarczynów- wapnia, sodu, magnezu lub amonowych z nadmiarem SO_2. Lignina jest przekształcana w lignino siarczyny, a hemiceluloza hydrolizuje do monomerów. Skład łuku posiarczynowego zależy od rodzaju drewna używanego w celulozowni. Ług z drewna drzew liściastych zawiera 3-5% substancji redukujących i są to głównie pentozy. Ług z drewna z drzew iglastych zawiera mniej substancji redukujących ok. 3%; za to w większości są to heksozy.

Ług posiarczynowy jest typowym odpadem produkcyjnym, stwarzającym zagrożenie dla środowiska naturalnego. ( 25 000- 40 000 mg O₂/dm³ ChZT)

Do hodowli na łuku posiarczynowym stosuje się głównie drożdże C. utilis, C. tropicalis gdyż potrafią utylizować zarówno heksozy, jak i pentozy. Znane są też przypadki stosowania S. cerevisiae. Oraz grzybów mikroskopowych Paecilomyces varioti. Biomasa jest produkowana na cele paszowe.

- pierwsza instalację do utylizacji ługu posiarczynowego uruchomiono w 1909 roku w Szwecji. Duże instalacje powstały w czasie II wojny światowej w Niemczech. Dosyć szeroko był ten proces rozpowszechniony do alt 50-tych.

HODOWLA NA SERWATCE:

Serwatka jest wartościowym produktem ubocznym przemysłu mleczarskiego. Jest to żółtawa ciecz otrzymywana po wytrąceniu kazeiny mleka. Duże ilości serwatki otrzymuje się w wytwórniach serów i twarogów, w zakładach produkujących kazeinę i precypitaty białkowe. Rocznie wytwarza się na świecie 36-45 ton serwatki. Jako produkt odpadowy stanowi ona odpad bardzo uciążliwy dla środowiska BZT₅ ok. 40-10*10³ mg O₂/dm^3.

Skład serwatki zależy od rodzaju mleka oraz technologii jego przetwarzania:

-serwatka kwasowa - otrzymywana po wytrąceniu kazeiny mleka na drodze fermentacji mlekowej,
-serwatka podpuszczkowa (słodka) - otrzymywana po enzymatycz­nym wytrąceniu kazeiny mleka za pomocą podpuszczki,
-serwatka włókiennicza (kwasowa) - otrzymywana po wytrąceniu kazeiny za pomocą kwasów solnego lub siarkowego.

Serwatka zawiera głównie cukier mlekowy oraz białka. Serwatkę w stanie naturalnym można stosować w żywieniu trzody. Z serwatki otrzymuje się również utrwalone i uszlachetnione preparaty paszowe.

Zwykle szczepy drożdży S, cerevisiae i C.utilis nie asymilują laktozy. Są jednak szczepy drożdży mające te cechę. Są to: C. kefyr, Saccharomyces fragilis, S. lactis.. te mikroorganizmy mogą wzrastać na serwatce.

HODOWLA NA WYWARZE GORZELNIAMYM:

Wywar gorzelniczy jest produktem ubocznym powstającym w gorzelniach. Jest to ciecz wyczerpana, pozostająca po oddestylowaniu etanolu z płynu po fermentacji etanolowej. Zawiera ona wiele składników pokarmowych. W wywarze znajdują się pochodzące z surowca, sole mineralne, pentozy, celuloza. W czasie fermentacji powstają substancje, które później znajdują się w wywarze: gliceryna, niektóre kwasy organiczne.

Wartośc ChZT wywaru dochodzą do 60 000 mg O₂/dm³

Najczęściej do drożdżowania wywaru stosuje się Drożdż z gatunku Torula torulopsis, Candida. Drożdże potrafią asymilować te substancje, które nie są przyswajane przez drożdże gorzelnicze: glicerynę, kwasy organiczne, pentozy. Drożdże te namnażane są na stacji czystych kultur w aparatach o działaniu okresowym, po dodaniu do wywaru soli fosforanowych, amonowych oraz melasy.

HODOWLA NA SKROBI:

Skrobia jest poliwęglowodanem- spolimeryzowana glukozą. Jedynie nieliczne szczepy drożdży mogą hydrolizować skrobie i dekstryny. Najpowszechniej stosuje się wstępną hydrolizę skrobi, a następnie dopiero hodowlę analogiczną jak w przypadku innych surowców węglowodanowych.

- interesującą metodą jest metoda SYMBA polegająca na wykorzystywaniu kultury mieszanej drożdży Endomycopsis fibuliger i Candida utilis E. fibuliger wytwarzają glukoamylaza, która hydrolizuje skrobię do cukrów prostych, głównie glukozy asymilowanej przez C.utilis. Wywodzi się z czystych kultur prowadzonych równolegle.

INNE HODOWLE:

Ciekłe węglodowodory (C₉-C₁₈) - C. lypolitica, C. tropicalis, C. oleophila, Saccharomyces lipolytica, Rhodotorula, Torulopsis.

Metan, metanol - Methylomonas, C. boidini, Trichoderma (odporne na stężenie metanolu 30 g/l, norma 10 g/l).

Wykorzystanie odpadowych substancji organicznych:

Produkcja biomasy mikroorganizmów może być efektywnym sposobem wykorzystania różnego typu odpadowych substancji organicznych. Można wskazac następujące grupy surowców:

-Odpady rolne — jest to duża grupa obejmująca odpady z hodowli zwierzę­cej i roślinnej. Zwykle zawierają względnie mało składników metabolizowanych. Wymagają zagęszczenia i hydrolizy alkalicznej dla zwiększenia stopnia przyswajalności oraz biologicznego przerobu dla podniesienia war­tości odżywczej.

-Odpady z przemysłu papierniczego — ług posiarczynowy, który omówio­ny został w rozdz. 10.4.3.
-Odpady browarniane — duża ilość odpadów organicznych, zwykle w pos­taci półstałej. Wytłoków używa się zwykle bezpośrednio w spasaniu trzo­dy, ale jest możliwe poddanie fermentacji stałej dla wzbogacenia w białka.
-Odpady przemysłu spożywczego — wytłoki sojowe, buraczane, pulpy owocowe itp. stosowane są jako składniki pasz. Podejmuje się prace nad ich wzbogacaniem w białko w wyniku fermentacji ciała stałego

- Przykład wykorzystania surowców odpadowych w Waterloo w Kanadzie. Proces polegał na przetworzeniu rolniczych odpadów z produkcji zwierzęcej w procesie beztlenowym. Płyn pohodowlany jest używany jako źródło azotu w fermentacji tlenowej. Surowcem węglowym jest słoma kukurydziana poddana hydrolizie alkalicznej.

Prowadzi się hodowle grzybów celulolityznych Chaetomium cellulolyticum. Hodowla prowadzona jest w sposób ciągły, ze średnim czasem przebywania w fermentorze 4-12 h. Temperatura hodowli wynosi 37 stopni.

Płyn pohodowlany jest filtrowany. Przesącz jest nietoksyczny i może być odprowadzany do ścieków. Osad z filtracji jest suszony w suszarniach bębnowych do ok. 10-12% wilgoci. Zawiera 25-35% białek i jest używany jako pasza.

Zastosowanie hodowli mikroalg:

Specyficzna dziedzina produkcji biomasy mikroorganizmów jest hodowla mikroalg. Proces polega na zastosowaniu fototrofów- mikroorganizmów wykorzystujących promieniowce słoneczne jako źródło energii oraz dwutlenek węgla jako źródło węgla.

Mikroalgi obejmują kilkaset rodzajów drobnoustrojów należących do dwóch grup:

-Eukariota (Chlorophyta, Rhodophyta, Bacillariophyta), do których należą algi zielone
-Prokariota (Anabaena, Oscillatoria, Spirulina, Corynebacterium, niebiesko zielone algi

- algi czerwone Rhodophyta

- okrzemki Bacillariophyta

Do hodowli w skali masowej stosowane są zielone algi Chlorella i Scenedesmus, niebiesko-zielone algi Spirulina.

Głównymi czynnikami wpływającymi na hodowle alg są:

-światło

-temperatura

-składniki odżywcze

-pH

Zastosowanie mikroalg:

Oczyszczanie ścieków - usuwanie związków biogennych (azot, fosfor).

Produkcja nawozów - stosowane jako nawóz azotowo-organiczny (1 kg alg może zastąpić 60 kg tradycyjnych nawozów azotowych).

Otrzymywanie chemikaliów - aminokwasów, lipidów, witamin, pigmentów, polisacharydów.

Białkowy komponent pasz.

Białkowa odżywka dla ludzi - białko, witaminy (dużo kwasów nukleinowych, zwiększa koszty produkcji).

Mikroalgi zawierają ponadto witaminy. Niestety z uwagi na wysoka zawartość kwasów nukleinowych, bezpośrednie zastosowanie mikroalg w odżywianiu ludzi jest ograniczone i nie może przekraczać 5% dziennego zapotrzebowania na białko.

8. UWARUNKOWANIA BIOTECHNOLOGIZNE PRODUKCJI ETANOLU:

Produkcja etanolu:

Schemat produkcji:
-czyszczenie surowca (woda),
-parowanie (gorąca para wodna, następuje częściowa hydroliza skrobi),
-zacieranie z zmielonym słodem (hydroliza enzymatyczna, 15-30 min.).
-fermentacja (2-3 doby),
-rektyfikacja - wielokrotna destylacja etanolu do stężenia azeotropowego (96,5%), etap najbardziej kosztowny i energochłonny.

Etanol jest bezbarwna cieczą, wrzącą w temperaturze 78,4 stopnie pod normalnym ciśnieniem 0,1013MPa.

Etanol jest bardzo ważnym surowcem w przemyśle chemicznym oraz rozpuszczalnikiem o szerokim zastosowaniu. Etanol jest także wartościowym paliwem.

Jako ciekły nośnik energii ma wiele zalet do których nalezą:

-cena

- wygoda w posługiwaniu się

- brak toksycznych produktów spalania, powodujących skażenie środowiska

Etanol może być otrzymywany na drodze syntezy chemicznej z etanu. Wytwarzanie etanolu przez fermentację jest jednak tańsze. W fermentacji etanolowej wykorzystywane są surowce odnawiane, co stanowi dodatkową zaletę metody biochemicznej nad chemiczną.

Surowce naturalne:
-zawierające cukry proste (melasa, serwatka, sok: z trzciny cukrowej, buraków cukrowych) - można stosować bezpośrednio,
-zawierające wielocukry (skrobiowe - ziemniaki, zboża; celulozowe - słoma, drewno) - należy zastosować obróbkę wstępną mającej na celu ich scukrzenie.

Wykorzystanie etanolu (gęstość 789,4 g/dm³, temperatura wrzenia 78,4˚C):
-jako paliwo - tani, wygodny, powstają nietoksyczne produkty spalania (dodatek do benzyn: do 20%),
-jako rozpuszczalnik - surowiec w przemyśle chemicznym.

Najważniejsze drobnoustroje fermentacji etanolowej:

Bakterie: Zymomonas mobilis: glukoza, fruktoza, sacharoza

Clostridium thermocellum: glukoza, celobioza, celuloza

Thermoanaerobium brockii: glukoza, sacharoza, celobioza, skrobia

Drożdze: Sacharomyces cerevisiae: glukoza, fruktoza

Sacharomyces uwarum: glukoza, fruktoza

Czynniki wpływające na produkcję etanolu:

Kwasowość - optymalne pH 4,5-4,7:
-poniżej 4,5 pH ogranicza ryzyko infekcji bakteryjnej,
-powyżej 4,7 pH wzrasta ilość glicerolu i kwasów organicznych w produktach.

Kwasowość brzeczki poddawanej fermentacji ma istotny wpływ na fermentację w warunkach przemysłowych.

Temperatura - optymalna 30-40˚C
-w wyższych temperaturach maleje aktywność drożdży oraz maleje odporność na toksyczne działanie etanolu, z tego względu, gdy stężenie etanolu wynosi 8-9%, temperatura fermentacji nie powinna zwykle przekraczać 30 stopni.

Rodzaj substratu - szczepy są D- lub L-specyficzne, większość nie fermentuje L-cukrów.

Stężenie cukru - optymalne 12-20%, wysokie stężenia hamują proces oraz ogranicza tolerancje drożdży na etanol.

Pożywki - źródło azotu (sole amonowe), fosforu (nawóz fosforowy, np. superfosfat), śladowe ilości witamin.

Rozpuszczony tlen - konieczne jest minimalne napowietrzenie (wzrost biomasy, zwiększenie produkcji etanolu)

Zanieczyszczenia mikrobiologiczne - bakterie kwasu octowego (Acetobacter) oraz kwasu mlekowego (Lactobacillus, Streptococcus). Bakterie kwasu octowego asymilują etanol w warunkach tlenowych z wytworzeniem kwasu octowego. Stanowią istotne zagrożenie jedynie we wstępnych etapach namnażania drożdży w warunkach tlenowych.

Bakterie kwasu mlekowego stanowią groźniejsze zanieczyszczenie mikrobiologiczne, gdyż metabolizują cukry przy niskim pH i w warunkach beztlenowych. Stosowane w gorzelniach środki zapobiegające kontaminacji, utrzymywaniu odpowiednich reżimów czystości oraz stosowaniu dużej ilości masy materiału szczepiennego, zwykle są wystarczające.

Metody prowadzenia fermentacji etanolowej:

Proces okresowy (bimbrownie, kadzie 50-1000m³):

Proces fermentacji okresowej jest najpowszechniej stosowany w małych instalacjach i gorzelniach rolniczych.
-warunki: 36-48 h, temp. 30-36˚C, początkowe pH 4-5, końcowe stężenie produktu 10-16%,
-zalety: łatwość operacji, niższe wymagania dotyczące sterylności, niskie ryzyko strat, łatwość podawania surowca,
-wady: niska produkcyjność.

Proces ciągły (kaskada bioreaktorów przepływowych):

Zwykle stosuję się kaskadę przepływowych fermentorów zbiornikowych ( od 3 do 5).
-stężenie etanolu 4-10% (przeciętna gorzelnia produkuje 60 m³ etanolu / dobę),
-zalety: pracochłonności i czasu obsługi, zwiększenie produkcyjności, możliwość ciągłej destylacji etanolu,
-wady: groźba infekcji wewnętrznej, trudność utrzymania wysokich szybkości fermentacji, niższe stężenie etanolu

Produkcja etanolu z surowców zawierających cukry proste i dwucukry:

1.produkcja etanolu z melasy:

Roztwory cukrów otrzymywane w przemyśle rolno-spożywczym stanowią atrakcyjny surowiec do produkcji etanolu, z uwagi na możliwość bezpośredniego wykorzystania w procesie fermentacyjnym.

Wysokie stężenie cukrów działa hamująco na rozwój mikroorganizmów.

W polskich warunkach surowcem zawierającym cukry jest melasa, powstająca w trakcie otrzymywania cukru. W procesie otrzymywania cukru wytwarzane są kolejno trzy melasy: A, B i C.

Melasa C powstaje jako końcowy produkt odpadowy, po wykrystalizowaniu większości sacharozy. Ta melasa jest wykorzystywana do produkcji etanolu w gorzelniach przemysłowych oraz jako składnik pożywek w wielu technologiach biochemicznych.

Wykorzystanie melasy A do produkcji etanolu może być podyktowane względami ekonomicznymi.

Substancje niefermentujące, zawarte w melasie, takie jak: sole nieorganiczne, koloidy organiczne, włókna, kwasy organiczne, mogą powodować trudności w procesie destylacji etanolu. Z tego względu wskazane jest usuniecie ich przed fermentacją.

- powszechnie stosowana metoda to kwaśna klaryfikacja, polegająca na dodaniu melasy ok. 0,5% kwasu siarkowego. Zakwaszoną melasę poddaje się następnie pasteryzacji, której towarzyszy precypitacja zanieczyszczeń. Oddzielenie osadów stałych odbywa się w temperaturach 70-95°C, gdyż główny składnik osadów- węglan wapniowy (CaSO₄* 2H₂0, jest trudniej rozpuszczalny w wyższych temperaturach (powyżej 30°C).

2.produkcja etanolu z ługu posiarczynowego:

Technologia surowca jest taka jak przy hodowli Drożdż na ługu i polega na usunięciu dwutlenku siarki.

W latach 40-tych i 50-tych wykorzystanie ługu posiarczynowego do produkcji etanolu było bardzo popularne. Na przykład pod koniec lat 40-tych w Szwecji 36 papierni produkowało około 114 tys. m³ etanolu rocznie.

3.produkcja etanolu z serwatki:

Własności i skład serwatki — omówiony przy temacie serwatka.

Fermentacji etanolowej poddaje się zwykle serwatkę odbiałczaną i zatężoną do około 20-30% suchej masy. Do fermentacji stosuje się specjalne szczepy drożdży asymilujących laktozę Kluveromyces fragilis.

Produkcja etanolu z surowców skrobiowych:

Skrobia jest polisacharydem zbudowanym z D-glukozy jako składnika podstawowego. Pełni funkcję substancji zapasowej. Składa się z dwóch składników strukturalnych: amylozy i amylopektyny.

Amyloza jest złożona z prostych długich łańcuchów o masie cząsteczkowej 4-150 tys. daltonów. Reszty glikozydowe połączone wyłącznie wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Amyloza warunkuje charakterystyczną reakcję skrobiowo-jodową, tzn. powstanie niebieskiego zabarwienia skrobi po dodaniu jodu. Amyloza tworzy w roztworze agregaty, które łatwo wypadają w postaci osadu.

Amylopektyna zbudowana z krótkich, prostych łańcuchów, zawierających ok. 30 jednostek glukozy, powiązanych wiązaniem 1,4. Te krótkie łańcuchy połączone są między sobą wiązaniami 1,6- glikozydowymi, tworząc razem rozgałęzioną strukturę. Masa cząsteczkowa przekracza 500 tys. daltonów.

Powoduje żelowanie skrobi.

- surowce skrobiowe to przede wszystkim zboża, ziemniaki i kukurydza

-w Polsce źródłem skrobi są ziemniaki oraz zboża. Zboża zawierają 60-75% skrobi z czego większość 70-80% to amylopektyny

- ziemniaki zawierają mniej skrobi niż zboża, bo około 15-25%. Zawartość amylozy jest zbliżona jak w ziarnach zbóż, za to amylopektyna ma krótsze łańcuchy, co ułatwia i przyspiesza hydrolizę.

Hydroliza skrobi:

Przetworzenie skrobi w cukry proste może być przeprowadzone za pomocą hydrolizy kwaśnej bądź za pomocą hydrolizy enzymatycznej. W enzymatycznej hydrolizie skrobi biorą udział enzymy hydrolizujące wiązania glikozydowe w skrobi do maltozy i glukozy zwane amylazami.

• Mamy 3 rodzaje amylaz:

Endoamylazy:
-α-amylaza - działa na wiązanie α-1,4-glikozydowych wewnątrz łańcucha, powstają oligosacharydy:
*pochodzenia bakteryjnego (termostabilna), np. B. licheniformis (powyżej 90˚C), produktem jest glukoza,
*pochodzenia grzybowego (termolabilna) - produktem jest maltoza i maltotrioza (większa odporność na pH).

W wyniku działania α-amylaz następuje rozpad wielkiej cząsteczki amylozy na mniejsze fragmenty zwane dekstrynami. Powoduje to szybki zanik barwnej reakcji z jodem, spadek lepkości i powolny przyrost redukcyjności roztworu. Ten rodzaj hydrolizy skrobi nosi nazwę upłynniania.

Egzoamylazy:
-glukoamylaza - działa na wiązania α-1,4-glikozydowe w łańcuchach bocznych, powstaje glukoza:
*pochodzenia grzybowego, odporne na wahania pH (A. niger pH = 1,8-8,8, A. awamori pH = 1,8-10,5),
-β-amylaza - działa na wiązania α-1-4-glikozydowe między drugą a trzecią jednostką glukozową, powstaje maltoza:
*pochodzenia roślinnego (zboża, jęczmień, soja),
-pullulanaza- działa na wiązania α-1,6-glikozydowe, usuwa rozgałęzienia:
*pochodzenia bakteryjnego (B. stearothermophilus).

W wyniku działania β-amylaz na amylozę powstają niskocząsteczkowe cukrowce, zwykle dwucukier maltoza składający się z dwóch cząsteczek glukozy. Obserwuje się szybki przyrost redukcyjności roztworu, za to zdolność do reakcji barwnej z jodem zanika powoli oraz wolno maleje lepkość roztworu. Ten typ hydrolizy określa się mianem scukrzenia skrobi.

W wyniku działania β-amylazy na amylopektynę powoduje rozkładanie bocznych łańcuchów do maltozy i reakcja zatrzymuje się na rozgałęzionych wiązaniach 1,6. W wyniku tego powstaje wielocząsteczkowa dekstryna graniczna, stanowiąca ok. 40-50% masy amylopektyny. Wykazuje ona znaczną lepkość oraz daje barwną reakcję z jodem.

Produkcja etanolu z surowców celulozowych:

1.ogólna charakterystyka

Surowce celulozowe stanowią potencjalne ogromne źródło surowców dla przemysłu biotechnologicznego. Znaczenie surowców celulozowych:

- rocznie dociera do Ziemi około 3,7*10²¹ KJ energii słonecznej. Nawet przy minimalnej sprawności procesu fotosyntezy energia w ilości około 2,6*10¹⁸ KJ jest przetwarzana do biomasy. Roczny przyrost zielonej biomasy wynosi około 8*10¹¹ t, z czego 40% stanowi celuloza

-obecnie wykorzystuje się zaledwie około 0,5% tej biomasy. Szacuje się, że około 40% zużywanej biomasy roślinnej staje się rocznie odpadami rolnymi, przemysłowymi, komunalnymi.

Celuloza - nierozgałęziony biopolimer, polisacharyd, o cząsteczkach złożonych z kilkuset do kilkunastu tysięcy jednostek glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi oraz β-1,6-glikozydowymi:
-endocelulaza - usuwa wiązania β-1,6-glikozydowe,
-egzocelulaza - działa na wiązania β-1,6-glikozydowe, na końcu łańcucha, powstaje celobioza lub stachioza (gal-gal-glu-fru),
-β-glukozydaza - działa na wiązania β-1,4-glikozydowe w celobiozie (glu-glu).

Celuloza jest wielocukrem strukturalnym, powszechnie występującym w roślinach. Z celulozy zbudowane są głównie ściany komórek roślinnych. Cząsteczka celulozy zbudowana jest z długiego łańcucha, składającego się co najmniej z 1500 reszt glukozy, połączonych ze sobą wiązaniami β-D-glikozydowymi.

Oprócz celulozy, w materiale roślinnym występują hemicelulozy. Są to wielocukry tzw. kwaśne, zawierające kwas glukuronowy.

Ściany komórkowe drewna są przeważnie martwe- stanowią materiał konstrukcyjny. Drewnienie ścian komórkowych, które prowadzi do ich usztywnienia i wzmocnienia, następuje w wyniku odkładania w ścianach komórkowych ligniny. Lignina jest aromatyczną substancją wielocząsteczkową, nie ulega fermentacji, gdyż nie zawiera w swojej strukturze cukrów.

2.przygotowanie surowców celulozowych

Surowce celulozowe wymagają wstępnej obróbki, służącej ułatwianiu hydrolizy surowca.

Podstawowym zadaniem tej obróbki jest usuniecie tzw. „ bariery ligninowej”, tzn. poddanie celulozy działaniu czynnika hydrolizującego.

Stosuje się zarówno metody fizyczne przygotowania surowców celulozowych, jak również obróbkę chemiczną.

Metody fizyczne: 1. Mielenie- drobne zmielenie materiału celuzowego jest wystarczające do przeprowadzenia hydrolizy enzymatycznej. Drobne mielenie nie zawsze jest uzasadnione ekonomicznie, zwłaszcza dla dużej skali produkcji. Ciekawym i efektywnym rozwiązaniem jest drobne mielenie na mokro z jednoczesna hydrolizą.

2.Parowanie- stosuje się bądź grzanie do temperatury 180-200°C przez 5-30 minut, bądź do temperatury 250°C w czasie 2 minut. W wyniku ogrzania surowca zachodzi termo hydroliza. Następnie poddaje się drewno rozprężeniu do ciśnienia atmosferycznego. W wyniku ekspansji następuje oddzielenie ligniny i wzrost powierzchni dostępnej dla hydrolizy enzymatycznej, co znacznie ułatwia dalszy proces.

Metody chemiczne:1. Ekstrakcja celulozy z ochronnej warstwy ligniny dokonywaną różnymi rozpuszczalnikami- stosowany jest rozpuszczalnik o nazwie Cadoxen , będący wodnym, alkalicznym roztworem etylenodwuaminy i tlenku kadmu. Do ekstraktu dodaje się wody, co powoduje precypitacje celulozy. Rozpuszczalnik jest zawracany do ekstraktora. 2.Traktowanie surowców celulozowych środkami spęczniającymi- Używane są roztwory wodorotlenku sodu, niektórych soli np. chlorku cynowego oraz aminy.

Spęcznianie surowca celulozowego jest wynikiem dwóch rodzajów procesów: międzykrystalicznego- powodowanego przez wodę, niezbędnego do dalszej degradacji biologicznej, oraz wewnątrzkrystalicznego- w wyniku działania reagentów chemicznych prowadzi on do zerwania mostków wodorowych.

Hydroliza kwaśna (kwas siarkowy) - do cukrów prostych, etanolu i furfaralu:
Kwaśna hydroliza jest typowym sposobem wydzielania fermentujących cukrowców z surowca celulozowego.

Rozróżnia się dwie główne klasy metod: 1. Metody, w których stosuje się wysokie stężenie kwasu; 2.metody, w których stosuje się niskie stężenie kwasu

+ działa niespecyficznie, nie wymaga wstępnej obróbki,
+ duża szybkość hydrolizy,
- powstają składniki hamujące fermentacje oraz korodujące aparaturę,
- konieczność prowadzenia procesów w podwyższonej temperaturze, pod zwiększonym ciśnieniem
- niska wydajność hydrolizy,
- duże koszty chemikaliów.

Hydroliza enzymatyczna (B. subtilis, C. cellobioparum, Trichoderma reesei) - do cukrów prostych, etanolu i krótkich węglowodorów:
-zalety: brak korozji, nie wymaga zmian temperatury oraz ciśnień:
+ umiarkowane warunki procesu,
+ wysoka wydajność hydrolizy,
+ powstaje czysty syrop cukrowy dobry do dalszej fermentacji,
- działania specyficzne, konieczność wstępnej obróbki (delignifikacja, Trichoderma viride lub mechaniczne rozdrobnienie),
- mała szybkość hydrolizy,
- kosztowne otrzymywanie enzymów.

Do hydrolizy celulozy stosuje się enzymy atakujące wiązanie 1,4-β-glikozydowe, zwane celulozami. Są one podobne do amylaz, które hydrolizują wiązanie 1,4- α- glikozydowe. Wyróżnia się trzy główne grupy enzymów celulolitycznych:

- endo-β-1,4-glukonazy- działają na wiązanie β-1,4-glukozowe

-egzo-β-glukonazy: β-1,4-glukonazo-glukohydrolaza, która hydrolizuje jednostki glukozowe od końca nieredukującego oraz β-1,4-glukozo-celo-biohydraza, która usuwa celobiozę z nieredukującego końca łańcucha.

-β-1,4 glukozydazy- hydrolizują celobiozę i krótkie łańcuchy oligosacharydów.

HYDROLIZA KWAŚNA	HYDROLIZA ENZYMATYCZNA
DZIAŁA NIE SPECYFICZNIE, NIE WYMAGA SWTĘPNEJ OBRÓKI ENZYMATYCZNEJ	DZIAŁA SPECYFICZNIE, WYMAGA PRZYGOTOWANIA SUROWCA
ROZKŁAD HEMICELULOZY NA SKŁADNIKI HAMUJĄCE FERMENTACJĘ	POSTAJE CZYSTY SYROP CUKROWY DOBRY DO DALSZEJ FERMENTACJI
OSTRE WARUNKI PROCESU, TEMPERATURA, CIŚNIENIE, AGRESYWNE ŚRODOWISKO	UMIARKOWANE WARUNKI PROCESU
DUŻE KOSZTY CHEMIKALIÓW	KOSZTOWNE OTRZYMYWANIE ENZYMÓW
DUŻA SZYBKOŚC HYDROLIZY	MAŁA SZYBKOŚC HYDROLIZY
OGÓLNA WYDAJNOŚC GLUKOZY JEST NISKA Z UWAGI NA DEGRADACJĘ PRODUKTU	MOŻLIWOŚC OSIĄGNIĘCIA WYSOKIEJ WYDAJNOŚCI HYDROLIZY

Napoje alkoholowe:

1.Produkcja piwa - surowcami są jęczmień, chmiel, woda i drożdże (górnej fermentacji S. cerevisiae, dolnej fermentacji S. uvarum).

Podstawowym surowcem do produkcji piwa jest jęczmień. Zawiera on mało cukru, a dużo skrobi, ponadto w ziarnach występują amylazy.

Otrzymanie brzeczki słodowej (cukry, dekstryny, białka, aminokwasy, substancje goryczkowe i garbnikowe oraz sole mine­ralne):
-zacieranie słodu → filtracja → warzenie z szyszkami chmielowymi → filtracja → chłodzenie.

Fermentowanie brzeczki przez drożdże i leżakowanie piwa:
-fermentacja → dojrzewanie → filtracja → piwo.

Gotowanie brzeczki z chmielem ma za zadanie:
-ekstrakcję i transformację związków chmielu,
-sterylizację brzeczki i inaktywację enzymów,
-nadanie brzeczce odpowiedniego smaku, zapachu i barwy,
-wytrącenie osadów (kompleksy białek z polifenolami) oraz usunięcie niepożądanych składników (siarczan dimetylu),
-zakwaszenie i zagęszczenie brzeczki.

2.Produkcja win:

Wino jest napojem alkoholowym wyrabiany z winogron Vitis Vinifera, o zawartości alkoholu od 9-18%. Dojrzałe winogrona mają smak słodko-kwaśny, zawierają bowiem cukier i pewne ilości kwasów organicznych. Zawartość cukru jest wystarczająca dla fermentacji i surowiec nie wymaga scukrzenia.

Schemat produkcji: rozdrabnianie → wyciskanie → siarkowanie → fermentacja → dojrzewanie → wino.

Winogrona poddaje się rozdrobnieniu, a otrzymana miazgę tłoczy się w celu wydobycia soku- moszczu.

Moszcz zawiera z reguły urozmaiconą mikroflorę z niezbędnymi do zafermentowania drożdżami. Drożdże te występują często jako lokalne rasy i stanowią czynnik określający jakość wina. Moszcz poddaje się siarkowaniu w celu zahamowania rozwoju bakterii. W technologiach tradycyjnych moszcz poddaje się fermentacji w beczkach drewnianych. Po 3,4-dniowym okresie zafermentowania następuje fermentacja burzliwa z wydzieleniem znacznych ilości dwutlenku węgla. Główne stadium fermentacji trwa 4-8 dni. Po ukończeniu fermentacji drożdże opadają na dno zbiornika.

Gatunki:
-początek - dzikie (Pichia fermentans, Candida crusei, Torulopsis stellata, Hansenula anomala),
-główny proces - szlachetne (S. cerevisiae, S. boyanus, S. ellipsoideus, S. rosei, S. chevalieri):
-koniec - szlachetne (Włochy, Czechy, Węgry - S. boyanus, Niemcy, Francja - S.cerevisiae).

Cechy dobrych drożdży winiarskich:

Procesu fermentacji win dokonuje się przy użyciu drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ własna mikroflora moszczów owocowych nie daje pewności przekształcenia ich w wina należytej jakości, wprowadza się drożdże tzw. szlachetne, np. Saccharomyces cerevisiae, Torulospor delbruecki
i inne. Szczepy drożdży winiarskich powinny mieć następujące cechy:

-szybkie i całkowite odfermentowanie,

-minimalne pienienie,

-szybką sedymentację po fermentacji,

-tworzenie małych ilości kwasów lotnych,

-wytwarzanie ubocznych produktów fermentacji korzystnie wpływających na cechy
-smakowo-zapachowe wina,

-zdolność rozkładania kwasu jabłkowego,

-odporność na duże stężenia kwasu siarkawego,

-odporność na wysokie ciśnienie CO₂ w przypadku produkcji win musujących,

-odporność na duże stężenie etanolu w przypadku produkcji win słodkich (deserowych),

-odporność na garbniki w przypadku produkcji win czerwonych.

Rodzaje win:

-wina czerwone - z ciemnych winogron, jego charakter zależy od garbników, głównie taniny, zawartych w skórkach i pestkach, trwająca 10-30 dni fermentacja odbywa się w wyższej temperaturze niż w przypadku win białych,
-wina białe - z białych lub czerwonych winogron (bez skórki), trwa dłuższej niż w przypadku wina czerwonego,
-wina różowe - są najczęściej produkowane tak samo, jak czerwone, ale ciemne skórki winogron usuwa się już

po 12-36 godzinach, otrzymuje się z czerwonych winogron w wyniku krótkotrwałego prowadzenia fermentacji w miazdze, a następnie w odfiltrowaniu moszczu.

-wino musujące-to wino otrzymane w wyniku wtórnej fermentacji, po wprowadzeniu do niego drożdży i cukru.

Oprócz winogron do wyrobu win stosuje się inne owoce. Np.:

- miody pitne- są to napoje fermentowane typu wino, otrzymywane z rozcieńczanych woda miodów pszczelich. Brzeczka miodowa oprócz miodu i wody może zawierać dodatkowo chmiel, przyprawy korzenne i ziołowe lub soki owocowe.

9. ZASTOSOWANIE I ZNACZENIE ENZYMÓW W BIOTECHNOLOGII:

Enzymy - są katalizatorami przemian biologicznych. Zasadniczym elementem budowy cząsteczek enzymu są białka. Ponadto w cząsteczek enzymu mogą występować składniki nie białkowe, np. koenzymy, aktywatory, inhibitory, metale stanowiące centra koordynacyjne.

Budowa enzymów:
-proste: część białkowa (apoenzym),
-złożone (holoenzym): część białkowa (apoenzym) i część niebiałkowa (koenzym, np. FAD, CoA lub grupa prostetyczna, np. Mg²⁺).

Złożona struktura cząsteczek enzymów określa zarówno możliwości katalityczne, jak i wrażliwość na wiele czynników środowiska. Enzymy charakteryzują się wysoka specyficznością w stosunku do substratu i funkcjonalną.

Specyficzność substratowa oznacza, że dany enzym katalizuje przemiany tylko określonego substratu lub grupy substratów do siebie podobnych.

Specyficzność funkcjonalna oznacza, że enzymy katalizują ściśle określona przemianę.

Klasyfikacja enzymów:
-oksydoreduktazy - katalizują reakcje utleniania i redukcji poprzez przenosze­nie protonów, elektronów (dehydrogenazy, oksydazy),
-transferazy - katalizują przeniesienie grup z jednego związku na inny związek (aminotrasferazy, kinazy),
-hydrolazy - katalizują reakcję rozpadu cząsteczek pod wpływem wody (esterazy, peptydazy, glikozydazy, amidazy),
-liazy - katalizują odłączenie od substratu grup, bez udziału wody (dekarboksylazy, deaminazy),
-izomerazy - katalizują odwracalnie trans­formację w odmiany izomery­czne związku (izomeraza glukozowa),
-ligazy - katalizują wytwarzanie wiązań między cząsteczkami (karboksylazy).

Enzymy są substancjami białkowymi, występującymi w różnorodnych mieszaninach. Z praktycznego punktu widzenia często nie jest istotne stężenie aktywnego białka, ale jego aktywność.

Aktywność enzymu - zdolność do wytwarzania 1 μmola produktu w czasie 1 minuty. Aktywność enzymów zależy od środowiska, jego składu i temperatury. Ma to istotne znaczenie zarówno dla produkcji enzymów, jak i ich wykorzystania.

Dla każdego enzymu istnieje optymalna temperatura, w której aktywność jest największa. W temperaturach wyższych od optymalnej, aktywność enzymów zmniejsza się w wyniku ich dezaktywacji. Aktywność zależy również od pH roztworu. Optymalne pH zależy od składu roztworu, temperatury i własności enzymu.

Zastosowanie enzymów:
-oszczędność surowców, zwiększenie wydajności,
-przyśpieszenie dojrzewania mięsa,
-poprawa jakości wyrobów skórzanych, zwiększenie trwałości.

Rodzaje enzymów:
-enzymy produkowane i stosowane w dużych ilościach; są to głównie enzymy hydrolityczne ( glukoamylazy, amylazy, proteazy i pektynazy).

- enzymy specjalne, produkowane w znacznie mniejszych ilościach, za to w formie bardzo czystej

Inhibitory - cząsteczki zmniejszające bezpośrednio aktywność enzymów.

Inhibicja nieodwracalna - kowalencyjna modyfikacja łańcuchów bocznych aminokwasów centrum aktywnego lub katalitycznego, np. aspiryna, penicylina, DFP, jodooctan.

Inhibicja odwracalna:
-kompetencyjna - inhibitor wykazuje strukturalne podobieństwo do substratu i konkuruje, z nim o związanie się w centrum aktywnym np. leczenia ludzi zatrutych metanolem - podając etanol;
-niekompetencyjna - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu i łączy się zarówno z samym enzymem jak i z kompleksem enzym-substrat, np. jony metali ciężkich (miedzi, rtęci).

Główne źródła enzymów:

Enzymy występują we wszystkich żywych komórkach. Jednakże synteza enzymów w komórkach związana jest z regulacja metabolizmu. Ilość syntetyzowanych enzymów jest zwykle mała i zależy od potrzeb danej komórki.

-Organy zwierzęce.

Ze ścian żołądków cieląt otrzymuje się podpuszczkę -preparat proteolityczny stosowany w serowarstwie. Z wątroby bydlęcej otrzymuje się enzymy proteolityczne: pepsynę, trypsynę oraz katalazę - enzym będący oksyreduktazą.
-Rośliny.

Kiełkujące ziarna różnych zbóż, tzw. słód, są wykorzystywane jako źródło preparatów amylolitycznych. Niektóre rośliny tropikalne stanowią źródło enzymów proteolitycznych. Z lateksu drzewa Carica papaya otrzy­mywana jest papaina, z soku fig — ficyna, zaś z łodyg ananasa — bromelaina.
-Mikroorganizmy.

W odpowiednich warunkach, wyselekcjonowane szcze­py drobnoustrojów mogą syntetyzować duże ilości enzymów. Producentami enzymów mogą być bakterie, drożdże i grzyby strzępkowe. Drobnoustroje mogą wytwarzać kompleksy enzymów; znane są też szczepy wydzielające w znacznych ilościach jeden tylko enzym.

Metody unieruchomiania enzymów:

Metody z wykorzystaniem oddziaływań fizycznych:
-immobilizacja oparta na adsorpcji i adhezji - drewno, celuloza, szkło porowate, jonity (DEAE-celuloza, CM-celuloza),
-pułapkowanie wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów - alginian, poliakrylamid, żywice,
-immobilizacja z wykorzystaniem półprzepuszczalnych membran - zamykanie w komórkach naturalnych (erytrocyty), kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie (liposomy, kapsułki nylonowe).
Zalety: zachowanie struktury enzymu, łatwość i niski koszt prowadzenia procesu.
Wady: wymywanie enzymu ze złoża.

Metody z wykorzystaniem oddziaływań chemicznych:
-immobilizacja poprzez tworzenie wiązań kowalencyjnych - silikażel i aldehyd glutarowy, diaminy, izomocznik.
Zalety: stabilność układu.
Wady: częściowa utrata aktywności enzymu (konformacja białka), wysokie koszty.

Zalety i wady technik immobilizacji enzymów:

Zalety:
-stabilizacja struktury białek (zwiększona termo stabilność i odporność na denaturacje),
-możliwość stosowania enzymów w środowisku organicznym,
-łatwe oddzielenie od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu (wysoka czystość produktu),
-możliwość wielokrotnego wykorzystywania enzymu,
-ograniczenie inhibicji enzymu, zarówno przez substrat jak i przez produkt (większa wydajność procesu),
-możliwość pracy w systemach ciągłych (z wykorzystaniem reaktora przepływowego).

Wady (można usunąć przez dobór prawidłowej metody immobilizacji dla potrzeb konkretnego procesu technologicznego):
-wysoki koszt, związany głównie z otrzymaniem czystego preparatu enzymatycznego,
-utrata aktywności wywołana zmianą warunków fizykochemicznych środowiska,

Zalety enzymów unieruchomionych:

-są mniej wrażliwe na czynniki zewnętrzne (PH, temperatura);

-są wykorzystywane przez dłuższy okres czasu i wielokrotnie;

-są przyjazne środowisku

-prosta technologia i aparatura do procesów z ich użyciem

-obniżone koszty technologiczne procesów z ich użyciem

-możliwość pominięci kosztownych i pracochłonnych metod ich izolacji i oczyszczania

-łatwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej

Biologiczne testowanie enzymów:

Toksyczność doustna: 4 tygodnie

Test na karcinogenosc - rak

Test na teratogenosc - płód

Toksyczność doskórna: podrażnienie skóry i oczu

Patogeniczność szczepów produkcyjnych, inokulacja odpowiednich pożywek

Główne enzymy produkowane na skalę przemysłową:

Proteazy bakteryjne	B. licheniformis B. amyloliquefaciens
Proteazy grzybowe	Mucor pusillus, M. miehei, A. oryzae, A. niger
Amylazy bakteryjne	Bacillus licheniformis Bacillus amyloliquefaciens
Amylazy grzybowe	A. niger A. oryzae
Glukoamylazy	Aspergillus, Rhizopus, Endomyces
Izomeraza glukozowa	Streptomyces olivaceus, S. wedmorenis, S. album, B. coagulans, Arthrobacter
Pektynazy	A. niger, A. wentii
Lipazy	Aspergillus, Rhizopus, Mucor
Oksydaza glukozowa	Penicillium
Katalaza	Aspergillus, Micrococcus lysodeikticus
Inwertaza	Saccharomyces

Przemysłowe wytwarzanie enzymów:

PREPARAT ENZYMATYZNY ZASTOSOWANIE

Biologiczne detergenty	bakteryjne proteazy, amylazy	proszki i płyny do prania
Przemysł spożywczy	lipazy	proszki i płyny do prania
Piekarnictwo	amylazy grzy­bowe	rozkład skrobi w mą­ce do cukrów
Browarnictwo	słód jęczmien­ny	rozkład skrobi do cu­krów prostych
Mleczarstwo	renina otrzymywana z żołądków młodych przeżuwaczy, produkcja serów	Produkcja serów

10. BIOTECHNOLOGIA A IMMUNOLOGIA:

Mechanizm działania antybiotyków- RNA, DNA, białko:

- ZAKŁOCENIE SYNTEZY KWASÓW NUKLEINOWYCH

-ZAKŁOCENIE SYNTEZY BIAŁEK- STREPTOMYCYNA

-ZAKŁOCENIE SYNTEZY ŚCIANY KOMÓRKOWEJ-PENICYLINA

-UPOŚLEDZENIE PRZEPUSZCZALNOŚCI BŁONY KOMÓRKOWEJ BAKTERII-GRAMICYDYNA

Swoista odpowiedź odpornościowa:

Odpowiedź humoralna - zależy od przeciwciał wydzielanych przez limfocyty B i jest podstawowym mechanizmem obronnym przeciw zewnątrzkomórkowym mikroorganizmom i toksynom:
-czynna: naturalna (przechorowanie) lub sztuczna (szczepienie),
-bierna: naturalna (otrzymanie przeciwciał przez łożysko lub z siarą) lub sztuczna (podanie surowicy)

Odpowiedź komórkowa - zależy od limfocytów T i pozwala zwalczać wewnątrzkomórkowe mikroorganizmy niedostępne dla przeciwciał, prowadzi do zniszczenia zainfekowanej komórki (fagocytoza, pinocytoza):
-czynna (powstanie aktywnych makrofagów stymulowanych limfokiną zdolnych do fagocytozy),
-bierna (przeniesienie komórek limfoidalnych lub ich ekstraktów).

Limfocyty B: to limfocyty szpikozależne, rodzaj limfocytów odpowiedzialnych za odpowiedź humoralna- produkcja przeciwciał niszczących antygeny. Powstają w szpiku kostnym i nigdy nie przechodzą przez grasicę.

Limfocyty T: to limfocyty grasico zależne, to rodzaj limfocytów odpowiedzialnych za odpowiedź komórkową- niszczą komórki obce dla organizmu. Powstają w szpiku kostnym, po czym wędrują do grasicy gdzie ulegają namnożeniu.

Immunizacja: polega na uodpornieniu organizmu na określony antygen:

- sposób naturalny: polega na przebyciu choroby

- sposób sztuczny- polega na otrzymaniu szczepionki

- bierna- organizm dostaje gotowe przeciwciała

Nieswoista odpowiedź odpornościowa:

Odpowiedź nieswoista- jest wrodzona, istnieje od urodzenia, nie jest skierowana na konkretny antygen

Bariery mechaniczne - skóra, błony śluzowe układu pokarmowego, oddechowego i moczowo-płciowego.

Bariery czynnościowe - kaszel, kichanie, perystaltyka jelit, aparat rzęskowy dróg oddechowych.

Bariery chemiczne - kwasy tłuszczowe na powierzchni skóry, lizozym, kwas solny żołądka.

Bariery mikrobiologiczne - flora bakteryjna organizmu.

Komórki żerne - makrofagi, neutrofile, bazofile, eozynofile, mastocyty (komórki tuczne).

Pamięć immunologiczna - skłonność do przyspieszonej i efektywnej odpowiedzi immunologicznej podczas ponownego kontaktu z antygenem, nawet po wielu latach od pierwszego kontaktu.

Immunogenność - zdolność cząsteczek do indukcji konkretnych przeciwciał.

Antygenowość - zdolność cząsteczek do reagowania z konkretnym przeciwciałem.

Epitop - fragment antygenu, zdolny do pobudzania komórki, aby produkowała konkretne przeciwciała:

Epitopy sekwencyjne - liniowe, składają się z sekwencyjnie ułożonych aminokwasów kodujących białko.

Epitopy konformacyjne - przestrzenne, zależne do struktur II-, III- i IV-rzędowych białka;

Antygen (antibody generator) - cząsteczka wywołująca odpowiedź odpornością

Immunogeny (duże cząsteczki) - wykazują antygenowość oraz immunogenność

Hapteny (małe cząsteczki) - wykazują antygenowość oraz immunogenność (w połączeniu z białkiem lub cukrem).

Immunoglobuliny - glikoproteiny wydzielane przez plazmocyty, które mają zdolność do swoistego rozpoznawania antygenów. Są to biała syntetyzowane przez komórki układu limfatycznego. Złożone z czterech glikozylowanych łańcuchów peptydowych połączonych ze sobą mostkami siarczkowymi:
-2 identyczne łańcuchy ciężkie (IgH) - wiązanie antygenu oraz funkcja efektorowa,
-2 identyczne łańcuchy lekkie (IgL) - wiązanie antygenu,
-region zawiasowy (miejsce zgięcia łańcuchów ciężkich).

Surowica: zawiera gotowe przeciwciała. Nie krzepnie, to płynna frakcja krwi, pozbawiona krwinek, płytek krwi

Szczepionka: zawiera antygen

Przeciwciała monoklonalne: to zbiór przeciwciał, które wykazują jednakową swoistośc względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Są to przeciwciała otrzymywane z jednego klony limfocytów B.

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych:

Otrzymanie komórek śledziony:
-immunizacja myszy antygenem z gęstym adwiuwantem (opóźnia metabolizm i zawiesza antygen)
-pobranie mieszaniny limfocytów i komórek plazmatycznych ze śledziony (po kilku tygodniach).

Otrzymanie komórek myeloma:
-komórki myeloma (nowotworowe), zmienione limfocyty dzielą się w niekontrolowany i nieograniczony sposób (nieśmiertelne),
-stosuje się linie z uszkodzonym genem fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HGPRT).

Fuzja komórek śledziony z komórkami myeloma = komórki hybrydoma:
-wymieszanie cytosoli oraz organelli (glikol polietylenowy rozluźnia błony),
-każda komórka hybrydoma, stale wytwarza homogenne przeciwciała o swoistości określonej przez macierzystą komórkę śledziony.

Selekcja komórek hymbrydoma, które nie uległy fuzji:
-selekcyjne podłoże HAT: pozwala na wzrost jedynie sfuzjowanym komórkom (hypoksantyna, aminopteryna - uniemożliwia zajście syntezy puryn alternatywną drogą metaboliczną, tymina, brak cytokin - limfocyty B, które nie uległy fuzji, ulegną apoptozie).

Klonowanie komórek hybrydoma przez `graniczne rozcieńczenia'.

Namnażanie komórek hybrydoma in vitro (μg/ml) lub in vivo (mg/ml).

Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych:

- chromatografia powinowactwa: można w ten sposób oddzielić ściśle określone białko z mieszaniny różnych białek z bardzo wysoka sprawnością

-immunoterapia: zastosowanie przeciwciała jest połączone z odpowiednim lekiem, po związaniu przeciwciała z odpowiednim antygenem

-immunodiagnostyka: oznaczanie obecności określonych antygenów w badanych próbkach np. określenie zgodności lub niezgodności tkankowej

Mechanizm powstawania limfocytów plazmatycznych i pamięciowych:

Komórki plazmatyczne: powstają w wyniku pobudzenia limfocytów B i są jedynymi komórkami zdolnymi do produkcji przeciwciał

Limfocyty pamięci: rodzaj limfocytów B powstający w czasie pierwotnego zakażenia patogenem

Komórki pamięci mają zdolność przemiany w komórki plazmatyczne, wytwarzające przeciwciała niszczące te rodzaje drobnoustrojów, które zaczęły atakować organizm. Po przebytym zakażeniu w ustroju komórki pamięci pozostają i są przygotowane do wytworzenia dużej ilości przeciwciał w krótkim czasie, jeśli ponownie się pojawi w organizmie ten sam rodzaj drobnoustroju chorobotwórczego.

Komórki pamięci powstają z uaktywnionego limfocytu B. Limfocyt ten może ulec podziałowi na 4 komórki plazmatyczne bądź właśnie na 2 komórki pamięci.

Cechy nośników:

Wektorem służącym do klonowania może być taki element genetyczny, który ma zdolność do namnażania się po wprowadzeniu do komórki biorcy.

Wektory powinny:

-zawierać geny tzw. markery selekcyjne, nadające komórkom gospodarza łatwy do testowania fenotyp np. oporność na antybiotyk

-posiadać unikalne miejsca restrykcyjne rozpoznawane przez enzymy w obrębie rejonów, w które można wstawić obcy DNA bez naruszenia zdolności replikacji wektora i możliwości selekcji zrekombinowanych cząsteczek

-być niezdolne do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu szczepach oraz nie posiadać zdolności koniugacyjnych.

Organizmy transgeniczne, antygeny pełnowartościowe, hapteny- definicja:

Organizmy transgeniczne - posiadają nowe geny, które są dziedziczone.

Antygeny pełnowartościowe: to inaczej immunogenny, to substancja, która może spowodować indukcję swoistej odpowiedzi odpornościowej

Hapteny: to antygeny resztkowe, są to drobnocząsteczkowe substancje, które normalnie nie mają zdolności indukowania odpowiedzi odpornościowej, wykazują tylko antygenowość

11. BIOTECHNOLOGIA A ANTYBIOTYKI

BIOTECHNOLOGIA A SZCZEPIONKI, SUROWICE, ANATOKSYNY

BIOTECHNOLOGIA A HORMONY: INSULINA, SOMATOTROPINA, HORMONY STERYDOWE

Antybiotyki:

Substancja naturalna, pochodzenia drobnoustrojowego oraz ich półsyntetyczne modyfikacje i syntetyczne analogi.

To naturalne, wytwarzane przez mikroorganizmy związki chemiczne, które hamują wzrost innych drobnoustrojów lub je niszczą. Do antybiotyków zalicza się obecnie również ich formy pochodne, zmodyfikowane na drodze chemicznej lub mikrobiologicznej.

Pierwszy antybiotyk, penicylina, odkryty został przez A. Fleminga w 1929 roku. Na początku lat 40 opracowano technikę przemysłowej hodowli jałowej.

Kolejny antybiotyk, streptomycyna, odkryty został w 1940 roku.

Chlorotetracyklina odkryta w 1948 roku była pierwszym antybiotykiem z bardzo ważnej grupy tetracyklin.

Cefalosporyna C odkryta została w roku 1955.

Zdolność do wytwarzania antybiotyków jest cecha szczepową. Większość stosowanych w terapii antybiotyków jest wytwarzana przez promieniowce, szczególnie przez drobnoustroje rodzaju Streptomyces - ok. 450 znanych gatunków rodzaju Streptomyes 240 wykazuje aktywność antybiotykową.

- promieniowce są nitkowatymi, gram-dodatnimi bakteriami, rosnącymi w środowisku tlenowym, tworzącymi rozgałęzione struktury. Występują obficie w glebach. Wytwarzają na specjalnych nitkach- sporo fach- zarodniki (konidia) służące do rozmnażania tych mikroorganizmów.

Cechy antybiotyków:

-metabolity muszą być wytwarzane przez drobnoustroje albo rośliny i zwierzęta

- określony kierunek działania

- mają działanie wybiórcze

- oligodynamicznośc- małe dawki, wytwarzanie antybiotyków to cecha szczepowa

Produkcja antybiotyków - małocząsteczkowe substancje naturalne, pochodzenia drobnoustrojowego lub ich półsyntetyczne modyfikacje albo syntetyczne analogi, które w mały stężeniu działają wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamując wzrost lub rozmnażanie komórek. W przyrodzie stanowią 10% puli metabolitów wtórnych (idiolitów).

Kryteria:
-kierunek działania: bakteriobójcze lub bakteriostatyczne (cykloseryna), synergiczne (penicylina z neomycyną) lub antagonistyczne,
-źródło biogenne,
-wybiórczość (g+/- tetracyklina, g+ penicylina, g- streptomycyna),
-oligodynamiczność (małe dawki, poniżej 1 ppm),

Producenci antybiotyków:
-promieniowce (6000): S. aureofaciens (tetracyklina), S.fradiae (neomycyna), S.erythreus (erytromycyna), S. griseus (streptomycyna),
-grzyby (2000): Tolyplocadium niveum (cyklosporyna C), A. fumigatus (fumagilina), P. chrysogenum (penicylina G),
-inne bakterie (1000): B. subtilis (bacytracyna), B. circulans (butyrozyna).

Działanie antybiotyków:

Zakłócenie procesów energetycznych lub oddechowych (antymycyna).

Hamowanie syntezy kwasów nukleinowych poprzez blokowanie matrycy albo polimerazy DNA lub RNA na poziomie:
-replikacji DNA (mitomycyna), -transkrypcji RNA (aktynomycyna).

Hamowanie syntezy białka poprzez blokowanie:

-funkcji rybosomów (aminoglikozydy), -wiązania tRNA (tetracykliny).

Zakłócenie funkcji błon biologicznych poprzez:
-zmiany w strukturze błony (polimyksyny), -transport jonów poza komórkę (gramicydyna).

Zakłócenie syntezy składników ściany komórkowej na etapie:
-syntezy peptydoglikan (wankomycyna), -transpeptydacji (penicylina).

Podział antybiotyków ze względu na toksyczność:

Antybiotyki nietoksyczne:
-beta-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny).

Antybiotyki umiarkowanie toksyczne:
-aminoglikozydowe (streptomycyna, neomycyna), -makrolidowe (erytromycyna),
-tetracykliny, -chloramfenicol.

Antybiotyki bardzo tyksyczne:
-polipeptydy (bacytracyna, kolistyna), -przeciwnowotworowe

Podział antybiotyków ze względu budowę chemiczną:

Pochodne aminokwasów:
-β-laktamowe (penicylina), -polipeptydowe (cyklosporyna),
-glikopeptydowe (wankomycyna),

Pochodne cukrów:
-aminoglikozydy (streptomycyna), -glikolipidy (moenomycyna).

Antybiotyki makrocykliczne:
-makrolidy właściwe (erytromycyna), -makrolidy polienowe (nystatyna).

Chinony i ich pochodne:
-antracykliny (aklarubicyna), -tetracykliny (chlorotetracyklina),
-benzochinony (mitomycyna).

Inne antybiotyki:
-pochodne cykloalkanów (cykloheksimid), -nukleozydy (polioksyna),
-polietery (lasalocid), -związki aromatyczne (chloramfenikol).

Wyodrębnianie antybiotyków:

Metody: - oddzielenie komórek od cieczy za pomocą filtracji lub wirowani

- wyodrębnienie, oczyszczenie antybiotyków; metody chromatoforowe

- zniszczenie błony cytoplazmatycznej

Produkcja penicyliny:

Przygotowanie materiału: rozmnażanie grzybów i biosynteza penicyliny w bioreaktorach

Etapy wyodrębnienia penicyliny:

-oddzielenie od reszty komponentów przez wirowanie lub filtrację

-zniszczenie błony plazmatycznej

-zniszczenie ściany komórkowej przez środowisko chemiczne

-chromatografia jonowa lub sorpcyjna

Oporność bakterii na antybiotyki.

-oporność mikrobiologiczną- w której oporne organizmy to te, które przejawiają jakąkolwiek formę mechanizmu oporności lub genu warunkującego oporność

-oporność kliniczną w której bakteria jest klasyfikowana jako
podatna lub oporna w zależności od reakcji na terapię

Przyczyny braku reakcji na antybiotyki:
-oporność naturalną (wrodzona) - stała cecha gatunku, szczepu lub całej grupy,
-oporność nabyta - w wyniku zmian w genomie na skutek mutacji (losowej) lub w wyniku nabycia od innych bakterii opornych genu,
-bezpośrednie mechaniczne rozrywanie komórek - przez ich ucieranie, rozcinanie, mielenie,
-działanie czynnikami fizycznymi - ultradźwięki, szok osmotyczny, gwałtowna dekompresja, zamrożenie i rozmrożenie,
-działanie czynnikami chemicznymi - rozpuszczalnikami organicznymi, detergentami, kwasami, które uszkadzają błonę komórkową.

Klasyfikacja wg Davisa i Maasa: MECHANIZM ZALEŻY OD:
-inaktywacja leku - zamiana na jego nieaktywna formę pochodną, z udziałem enzymów wytwarzanych przez komórki oporne.
-modyfikacja miejsca komórkowego wrażliwego na lek,
-zahamowanie transportu leku do opornej komórki,
-wytworzenie alternatywnej drogi pozwalającej ominąć etap wrażliwy na lek,
-zwiększenie poziomu enzymu, który podlega inaktywacji,
-zwiększenie poziomu metabolitu, który jest antagonistą inhibitora,
-zmniejszenie zapotrzebowania na produkt tej drogi metabolicznej, która podlega zahamowaniu.

Opracowanie nowego leku:

Pozyskiwanie szczepów - ze środowiska lub kolekcji.

Skrining wstępny - hodowla, testy in vitro.

Otrzymywanie czystego produktu - biosynteza, izolacja produktu (identyfikacja i ewentualna modyfikacja struktury chemicznej).

Badanie aktywności biologicznej produktu - opracowanie formy leku, testy na zwierzętach (myszy, szczury), badania kliniczne.

Uruchomienie produkcji nowego leku - rejestracja leku, optymalizacja technologii, ulepszenie szczepów.

Claviceps purpurea - grzyb pasożytujący na zbożach, wytwarza przetrwalniki w postaci długich, purpurowoczarnych rożków.
Sporysz zawiera wiele alkaloidów - ergotaminę oraz aminokwasy - tyrozynę, tryptofan, histydynę, leucynę, kwas asparaginowy.

Ergotamina - alkaloid sporyszu o budowie strukturalnej zbliżonej do amin biogennych (noradrenaliny, serotoniny i dopaminy), posiadający zdolność do wiązania się z ich receptorami. Powoduje skurcz mięśni gładkich macicy i naczyń krwionośnych. Otrzymuje się z niej kwas lizergowy, którego używa się do produkcji LSD.

Leuconostoc- są to paciorkowe heterofermentatywne. Do tego rodzaju nalezą dwa przemyśle spożywczym gatunki:

Leukonostoc Citororum- występuje w mleku w którym z cukru i kwasu cytrynowego wytwarza dwuacetyl nadająy masłu charakterystyczny aromat.

Leukonoctoc Nesenteroides- paciorkowce te na podłożu z sacharozą wytwarzają bardzo dużo śluzu. Jest nie pożądany w cukiernictwie gdzie powoduje śluzowacenie słodów i zatyka przewody.

Produkcja witamin

Witaminy spełniają ważne funkcje w organizmie. Stanowią one niebiałkowe komponenty enzymów. Brak witamin powoduje hamowanie odpowiednich przemian enzymatycznych z uwagi na brak koenzymu.

Witaminy rozpuszczalne w wodzie to witaminy z grupy: B, P, C, INOZYTOL, CHOLINA

Witaminy rozpuszczalne w TŁUSZCZACH to witaminy z grupy: A, D, E, K

Witamina B₁₂

Cyjanokobalina, odkryta została w roku 1948. Stanowi ona czynnik zapobiegający anemii złośliwej, Otrzymywana jest przez bezpośrednią fermentację przy użyciu bakterii: Propionibacterium shermanii, Pseudomonas denitrificans, Rhodopseudomonas protamicus.

Jako surowiec stosuje się glukozę, wyciąg kukurydziany oraz sole kobaltowe. Proces prowadzi się w warunkach beztlenowych przez 3 dni, a następnie tlenowo przez kolejne 3-4 dni.

Znaczna cześć witaminy pozostaje wewnątrz komórek. Oddzielona po filtracji biomasa jest suszona i stanowi cenny składnik pasz.

Metody wydzielania cyjanokobaliny z roztworu po hodowli:

-filtracja → ekstrakcja (etanol, KCN) → oczyszczanie
-sorpcja na węglu aktywnym → desorpcja (aceton 95%) → sorpcja na węglu aktywnym → desorpcja (woda amoniakalna)
-krystalizacja → produkt

Witamina B₂

Ryboflawina stosowana w medycynie, weterynarii oraz w hodowli zwierząt jako dodatek do pasz. Produkowana jest w skali przemysłowej trzema metodami:
-pełna synteza chemiczna,
-synteza chemiczna z D-rybozy otrzymanej z hodowli mikroorganizmów,
-synteza biologiczna.

W pełnej syntezie chemicznej ryboflawiny surowcem wyjściowym jest glukoza. W metodzie półsyntetycznej wykorzystuje się jako surowiec D-rybozę, otrzymywana w wyniku hodowli mutantów Bacillus subtilis lub Bacillus pumilus.

Dzięki bezpośredniej fermentacji otrzymuje się około 30% produkcji ryboflawiny. Wiele drobnoustrojów wykazuje zdolność do wytwarzania witaminy B₂. Bakterie Clostridium acetylobutylicum w procesie beztlenowym wytwarzają do 0,1 kg ryboflawiny/m³, Drożdże z gatunku Candida, np. Candida Glarus, wytwarzają około 0,6 kg/ m^3. Najlepszą wydajność wykazują promieniowce Ashbya gossypii- do 10 kg/ m³

Preparaty paszowe witaminy B₂ otrzymuje się bądź w wyniku bezpośredniego wysuszenia brzeczki pofermentacyjnej, przez działanie zasadowych proteaz na płyn pohodowlany w temperaturze 60°C i następnie wydzieleniu fazy stałej przez chłodzenie.

Witamina C:

Kwas askorbinowy. Bark tej witaminy wywołuje chorobę zwaną szkorbutem. Witamina C jest związkiem powszechnie stosowanym w lecznictwie. Warto wiedzieć, że jedynie organizmy: ludzki, małp wyższych i świnki morskiej nie są w stanie same produkować witaminy C, gdyż nie zawierają enzymu dehydrogenazy kwasu L- gula nowego, przekształcającej ten kwas w kwas askorbinowy.

Kwas askorbinowy otrzymywany jest metodami chemicznymi z glukozy. Np. proces prowadzony za pomocą bakterii Acetobacter suboxidans w warunkach intensywnego natlenienia. Hodowla trwa od 14 do 40 godzin. Temperatura hodowli wynosi 30°C. Wydajność przemiany 90-95%. Płyn hodowlany oddzielany jest przez filtrację, zagęszczany w wyparkach próżniowych i poddawany krystalizacji.

Produkcja egzosacharydów:

Dekstran - substytut plazmy krwi (L. mesenteroides, Klebsiella, Acetobacter).

Alginian - lody, błyskawiczne budynie i kremy, środek powierzchniowy w produkcji papieru (Azotobacter vinelandii, P. aeruginosa).

Ksantan (celuloza z trzycukrowymi podstawnikami) - dodatek do napojów, miękkich serów, bita śmietana (Xanthomonas campestris).

Pullan - czynnik osłaniający w produktach spożywczych (Aureobasidium).

Kurdlan - czynnik żelujący w budyniach (Alcaligenes faecalis).

Produkcja interferonu.

Interferony to grupa związków, będących czynnikami niespecyficznej odporności organizmu. Działają hamująco na rozwój wirusów w komórce, modyfikują działanie systemu odpornościowego oraz regulują szybkość podziału komórek. Interferony jako produkty fizjologiczne nie wywołują w organizmie ludzkim szkodliwych działań ubocznych, nie mają własności antygenowych. Stanowią cenny lek w leczeniu chorób wirusowych. Pewnie nadzieje wiąże się z interferonami.

Induktory interferonu:
-naturalne (wirusy, bakterie, w tym endotoksyny, pierwotniaki),
-sztuczne (cykloheksimid, polifosforany, polisiarczany).

Rodzaje interferonów:
-interferon α (białko, m.cz. 16 000 - 23 000) - produkowany przez ludzkie leukocyty:
-interferon β (glikoproteina, m.cz. 20 000) - produkowany przez diploidalne fibroblasty,
-interferon γ, immunologiczny (glikoproteina, m.cz. 20 000 - 25 000) - produkowany przez ludzkie limfocyty T.

Klasyczna metoda otrzymywania interferonu polega na wydzieleniu z osocza krwi ludzkiej. Tak otrzymany interferon był bardzo drogi.

Interferon α można otrzymywać z hodowli leukocytów zainfekowanych odpowiednim wirusem. Czysty preparat otrzymuje się, podobnie jak inne produkty białkowe, w wyniku kilkuetapowego oczyszczania, m.in. metodami chromatograficznymi.

Interferon β można otrzymywać z hodowli diploidalnych komórek ludzkich traktowanych odpowiednim induktorem. Hodowle prowadzi się w monowarstwie.

Interferon γ można otrzymywać z hodowli ludzkich limfocytów T. Wydzielone limfocyty traktowane są surowicą przeciwlimfocytową lub miogenem.

- odrębną techniką jest otrzymywanie interferonu w wyniku zabiegów inżynierii genetycznej. Dzięki manipulacjom genetycznym udało się wprowadzić gen kodujący wytwarzanie interfonu do bakterii E.coli, co umożliwiło otrzymywanie interferonu w wyniku klasycznej hodowli bakterii.

Sterydy:

Są to związki zawierające w cząsteczce czteropierścieniowy układ cyklopentanoperhydrofenantrenu (steranu). Związki te odgrywają istotną rolę w organizmie ludzkim. Ważne znaczenie farmakologiczne mają hormony i nadnercza- kortykosteroidy, hormony płciowe żeńskie- estrogeny i gestageny oraz hormony męskie- androgeny. Sterydy otrzymywane są w wyniku przemian chemicznych, przy czym istotną rolę odgrywają procesy biotransformacji.

Do produkcji leków sterydowych ważne znaczenie mają następujące biotransformacje:

- wprowadzenie grupy hydroksylowej w pozycję C-11 steranu (Rhizopus)

wprowadzenie grupy hydroksylowej w pozycję C-16 (Streptomyces)

- uwodornienie pierścienia w pozycji C-1(Corynebacterium simplex)

-redukcja grupy ketonowej przy C-17 lub C-20 ( Saccharomyces)

Produkcja hormonów.

Biotransformacja (oleje roślinne: diosgenina, stygmasterol, β-, γ-sitosterol)::
-produkcja hormonów steroidowych (kortykosteron, estrogeny, gestageny, androgeny).

Transformacja plazmidowa (E. coli):

-produkcja hormonu wzrostu - wydzielany przez przysadkę mózgową, biologiczną aktywność uzyskuje za pośrednictwem somatomedyny (wytwarzanej w wątrobie), zahamowanie następuje pod wpływem somatostatyny (wytwarzanej przez podwzgórze), która jest także antagonistą insuliny, glukagonu oraz pepsyny,
*działanie: pobudzanie wzrostu masy ciała i wzrost, zwiększenie poziomu cukru oraz wolnych kwasów tłuszczowych,
*budowa: 191 aminokwasów, zawierające dwa mostki disiarczkowe,

-produkcja insuliny - wydzielana przez trzustkę (9 l bakterii / 10 000 cieląt):
*działanie: transport glukozy do wnętrza komórek, co obniża poziom glukozy we krwi,
*budowa: 51 aminokwasów, 2 łańcuchy polipeptydowe A i B, połączone dwoma mostkami disiarczkowymi,
*analogi insuliny (modyfikacja aminokwasów): szybkodziałające i długodziałające.

Insulina: anaboliczny hormon peptydowy o działaniu ogólnoustrojowym, odgrywający zasadniczą rolę przede wszystkim w metabolizmie węglowodanów, lecz także białek i tłuszczów. Insulina została odkryta w 1922 przez Fredericka Bantinga. Insulina produkowana jest przez wysp trzustki. Najważniejszym bodźcem do produkcji insuliny jest poposiłkowe zwiększenie stężenia glukozy we krwi.

Szczepionka - produkt pochodzenia biologicznego zawierający substancje zdolne do indukcji określonych procesów immunologicznych warunkujących powstanie trwałem odporności bez wywołania działań toksycznych:

Podział szczepionek ze względu na antygen:
-szczepionki żywe o osłabionej zjadliwości (atenuowane) - przeciwko odrze, śwince, różyczce, wietrznej ospie, żółtej gorączce,
-szczepionki inaktywowane (zabite) - przeciwko wściekliźnie, grypie, zapaleniu wątroby typu B,
-szczepionki żywe (o pełnej wirulencji) - przeciwko ospie prawdziwej (zawiera wirus krowianki),
-anatoksyny (egzotoksyny pozbawione właściwości toksycznych) - przeciwko tężcowi, błonicy,
-autoszczepionki - sporządzana z drobnoustrojów pochodzących z organizmu chorego i tylko dla niego przeznaczona.

Podział szczepionek w zależności od swoistości:
-szczepionki monowalentne - zawierają jeden rodzaj antygeny pochodzące od jednego drobnoustroju,
-szczepionki poliwalentne - zawierają więcej niż jeden antygen pochodzące od jednego lub różnych drobnoustrojów

Podział szczepionek w zależności od postaci:

-szczepionki płynne dostępne w postaci gotowej do podania

-szczepionki wysuszone mają postać proszku, który przed użyciem należy wymieszać z dołączonym
rozpuszczalnikiem.

Cechy idealnej szczepionki:
-skuteczność (wywołanie swoistej trwałej odporności u 100% szczepionych już po jednorazowym podaniu);
-bezpieczeństwo (brak działań niepożądanych);
-trwałość, łatwość podawania, niska cena;
-łatwość i bezpieczeństwo produkcji.

- mianowanie - określanie ilości białka, która wywołuje odpowiedź odpornościową.

Szczepionki rybosomalne:

W 1965 roku odkryto immunologiczny efekt rybosomów bakteryjnych.

zalety:

-brak toksyczności

-bardziej wyrazista immunogenność,

-możliwość uodpornień przeciwko większemu spektrum chorób

Metody produkcji są zbliżone jak dla innych preparatów wewnątrzkomórkowych i obejmują:

- hodowle odpowiednich drobnoustrojów

-dezintegracja komórek

- wytrącenie substancji balastowych

- wytrącenie frakcji rybosomalnej

-oczyszczanie preparatu

Antytoksyna

Szczepionki te są bakteryjnymi toksynami, które pod wpływem formaldehydu i podwyższonej temperatury zostały pozbawione toksyczności, z zachowaniem zdolności do stymulowania wytwarzania przeciwciał. Anatoksyny stosuje się w zapobieganiu chorobom zakaźnym, wywoływanym działaniem jadów bakteryjnych (egzotoksyn). W powszechnym użyciu są anatoksyny błonicze i tężcowe, stosowane jaki pojedyncze szczepionki lub wchodzące w skład szczepionek skojarzonych. Znane są anatoksyny botulinowe (jad kiełbasiany) oraz anatoksyna gronkowcowa.

Produkcja anatoksyn:

-hodowla toksyno twórczych szczepów bakteryjnych

-odtoksycznienia przez działanie formaldehydu w temperaturze 37-39°C

-zatężenia i oczyszczenia anatoksyn: stosowane są analogiczne metody separacji jak w technologii wytwarzania oczyszczonych preparatów enzymatycznych.

Szczepionka aktywna: żywa, to szczepionka zawiera żywe drobnoustroje, które mają znikome właściwości chorobotwórcze lub są ich pozbawione jednak zachowują swoje właściwości antygenowe. Stosuje się je w celu zapobiegania gruźlicy, poliomyelitis, ospie, odrze, żółtej febrze.

Atenuacja jest procesem selekcji mutantów o zmniejszonej zjadliwości. Uzyskuje się je przez odpowiednio długie hodowle lub wielokrotne pasażowanie na zwierzętach laboratoryjnych.

Szczepionki inaktywowane: szczepionki te zawierają zabite drobnoustroje przy użyciu ciepła, substancji chemicznych lub promieniowania. Stosowane do zapobiegania chorobom bakteryjnym takim jak: krztusiec, dur brzuszny. Odporność po tego typu szczepionkach bywa znaczna, ale słabsza niż po szczepionkach żywych czy anatoksynach. Bakterie po hodowli są zabijane termicznie lub chemicznie za pomocą formaliny, fenolu, etanolu lub acetonu.

Do tej grupy należą:

Autoszczepionki: to szczepionka własna, jest szczepionką przygotowana z zabitych drobnoustrojów uprzednio izolowanych z ogniska zakażenia od chorego i stanowiących odpowiedzialny za to zakażenie czynnik etiologiczny.

Szczepionka sporządzona z zabitych szczepów bakteryjnych świeżo izolowanych od chorego.

Surowice i szczepionki:

Szczepionki i surowice odgrywają podstawowa role w profilaktyce i leczeniu chorób zakaźnych. Szczepionki stosowane są w celu wywołania reakcji immunologicznej organizmu i uzyskania w ten sposób czynnej odporności.

Odporność taka charakteryzuje się długim okresem trwania i skutecznością w zapobieganiu określonej chorobie. Odporność bierna uzyskuje się w sposób sztuczny, przez zastosowanie ludzkiej lub zwierzęcej surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała lub immunoglobuliny. Odporność ta jest krótkotrwała i mniej skuteczna niż odporność czynna.

Antygen to każda substancja ożywiona lub nieożywiona, która pobudza organizm do odpowiedzi immunologicznej w postaci syntezy przeciwciał lub powstania komórek uczulonych i reaguje z nimi w sposób swoisty. Antygen i przeciwciało określają siebie wzajemnie.

Szczepionka jest to odpowiednio przygotowany preparat zawierający antygen w formie żywych lub zabitych drobnoustrojów albo produktów ich metabolizmu. Obecność antygenu w szczepionce wywołuje reakcję immunologiczną, co prowadzi do uzyskania odporności czynnej- organizm potrafi wytwarzać przeciwciała dla zwalczania infekcji.

Surowica są preparatami zawierającymi „gotowe” przeciwciała lub immunoglobuliny. Uzyskuje się dzięki temu jedynie odporność bierną. Surowice wytwarzane są z ludzkiej lub zwierzęcej surowicy krwi.

Pierwsza szczepionka była to szczepionka przeciwko ospie użytą przez Edwarda Jennera w 1796 roku. Zastosował on zarazki ospy bydlęcej do wywołania odporności u ludzi.

W 1881 roku Pasteur opracował szczepionkę przeciwko gruźlicy, zaś w roku 1885 przeciwko wąglikowi.

Pierwsze anatoksyny zawdzięczamy Ramonowi, który opracował anatoksynę błoniczą 1923 roku, następnie anatoksynę teżcową.

Szczepionki używane przez ludzi można podzielić na 4 grupy:

- szczepionki przygotowane z żywych drobnoustrojów, których właściwości chorobotwórcze zostały osłabione przez odpowiednie zabiegi- szczepionki atentowane(aktywne)

-szczepionki przygotowane z drobnoustrojów zabitych środkami fizycznymi lub chemicznymi, mogą składać się z całych komórek lub ich frakcji

-szczepionki przygotowane z przetworzonych produktów metabolizmu bakterii

-szczepionki uzyskane z fragmentów komórek lub wirusów

Źródło pozyskiwania drobnoustrojów surowicy odpornościowej:

Surowica odpornościowa: surowica o dużej zawartości swoistych przeciwciał otrzymywana w wyniku naturalnego lub sztucznego uodpornienia określonym antygenem. Jest to preparat zawierający gotowe przeciwciała natychmiast niszczące wrogie dla ustroju antygeny.

Uzyskuje się z:

- najczęściej z krwi zwierząt lub ludzi, którzy przebyli zakażenie albo zostali sztucznie uodpornieni

- czasami pacjentom zamiast surowicy która zawiera konkretne przeciwciała podaje się gamma-globuliny człowieka

Gamma-globuliny: to zagęszczona surowica krwi ludzi zdrowych

12. ZASTOSOWANIE BIOTECHNOLOGII W PRZEMYSLE SPOŻYWCZYM

ZASTOSOWANIE BIOTECHNOLOGII W ROLNICTWIE

1. Przetwory mleczne:

Mleko ma dużą wartość odżywczą. Zawiera białko, cukier, tłuszcze, witaminy oraz sole mineralne.

Na skład chemiczny mleka, a przede wszystkim zawartość białka i tłuszczu, wpływają czynniki genetyczne, fizjologiczne i środowiskowe.

Białko jest podstawowym składnikiem mleka. Ponad 80% białek mleka stanowi kazeina, pozostałe białka to albumina i globulina.

Kazeina jest fosfoproteidom zawierającym oprócz peptydowo powiązanych aminokwasów, estrowo związany kwas fosforowy. Kazeina nie jest jednorodnym białkiem, lecz składa się z kilku frakcji o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych. Z uwagi na trudności z przechowaniem surowego mleka, znaczna część jest sprzedawana w postaci produktów mleczarskich. Wiele tych produktów otrzymywanych jest metodami biotechnologicznymi.

Produkty fermentacji mleka:

- produkty otrzymywane w wyniku działania mezofilnych bakterii kwasu mlekowego (L. lactis, L. casei): mleko zsiadłe, maślanka, twaróg.

- produkty otrzymywane w wyniku fermentacji za pomocą specjalnych termofilnych bakterii kwasu mlekowego (L. delbrueckii, S. thermofilus): jogurt.

- produkty otrzymywane za pomocą specjalnych mezofilnych lub termofilnych kultur, zawierających, obok typowych bakterii kwasu mlekowego, również inne bakterie lub drożdże, lub wytwarzane za pomocą innych bakterii, np. kefir, kumys.

• Produkty fermentacyjnego przerobu mleka zawierają łatwo przyswajalny wapń w postaci mleczanu wapnia. Charakteryzują się obniżoną zawartością laktozy, co jest istotne dla ludzi p niskiej tolerancji na ten cukier.

• W wyniku fermentacji mlekowej następuje wzrost stężenia jonów wodorowych. W Ip następuje rozpad kompleksu fosfo-kazeinowo-wapniowego. Odszczepia się od niego wapń i powstaje nierozpuszczalna w wodzie kazeina, zwana kazeiną kwaśną. Wytrącony skrzep tworzą spojone ze sobą cząsteczki kazeiny oraz woda pozostająca w siatce skrzepu. W przypadku mlecznych napojów fermentowanych skrzep nie jest oddzielony od roztworu. W produkcji twarogów i niektórych typów serów oddziela się skrzep od pozostałego roztworu, zwanego serwatka kwaśną.

Zsiadłe mleko-jest uzyskiwane w wyniku fermentacji ochłodzonego mleka bakteriami Streptomyces lactis, Leuconostoc cremoris. Proces trwa około 16 godzin.

Kwaśna śmietanka-otrzymywana jest ze śmietany o zawartości tłuszczu 10% lub 20-25%. Śmietanę, po homogenizacji, inkubuje się w temperaturze 18-20°C z dodatkiem odpowiedniej kultury mikroorganizmów. Po około 9 godzinach fermentacji pH zmniejsza się do 4,9-5,1. Produkt jest schładzany i służy głównie do produkcji masła.

Maślanka-jest ubocznym produktem przy produkcji masła. Może być wykorzystywana bezpośrednio, zużyta na cele paszowe, przerobiona na napoje lub wykorzystywana jako surowiec do otrzymywania preparatów białkowych. Do sprzedaży kieruje się tzw. maślankę spożywczą, wyprodukowaną przy wyrobie masła ze śmietany pasteryzowanej i ukwaszonej za pomocą czystych kultur. Do zakwaszenia śmietany stosuje się szczepionki, w skład których wchodzą mezofile bakterie fermentacji mlekowej: Streptococcus lactis, S.cremonis, Leuconostoc cremoris. Oprócz kwasu mlekowego wytwarzają one także związki aromatyzujące. Ukwaszona śmietana poddawana jest zmaślaniu. Jest to proces mechaniczny, prowadzący do aglomeracji tłuszczu i wydzielenia maślanki.

Jogurt-produkowany jest z mleka o różnej zawartości tłuszczu, za pomocą specjalnych szczepów bakterii, przeznaczonych wyłącznie do tej produkcji. Są to termofilne bakterie Streptococcus thermophilus oraz Lactobacillus bulgaricus, żyjące w symbiozie.

Streptococcus thermophilus obniza potencjał erdoks roztworu i wytwarza kwas mrówkowy, który sprzyja wzrostowi Lactobacillus bulgaricus. Te ostatnie bakterie wykazują silna aktywność proteolityczną.

Kefir-jest napojem mlecznym się z Kaukazu. Wyrabiany jest z różnych rodzajów mleka. Zawiera 0,8-1% kwasu mlekowego, 0,3-0,8% etanolu. Do wyrobu kefiru stosuje się tzw. grzybki kefirowe (skupiska drobnoustrojów sklejone ze sobą śluzem). Mikroflora symbiotyczna obejmuje homo i hetero fermentujące bakterie kwasu mlekowego: Lactobacillus kefir, mezofile ziarniaki Streptococcus lactis|cremoris|diaetilactis, bakterie Leuconostoc cremoris wytwarzające związki aromatyczne oraz fermentujące laktozę drożdże Saccharomyces kefir, Candida kefir.

Produkcja serów:

Sery są skoncentrowanymi produktami zawierającymi podstawowe składniki mleka: białko i tłuszcz. Uzyskuje sie je w wyniku działania podpuszczki, pepsyny lub proteolitów mikrobiologicznych, powodujacych powstawanie skzrepu parakazeinianiu wapnia. Charakterystyczne jest powstawanie serwatki jako produktu ubocznego.

Działanie podpuszki na mleko jest procesem złożonym. W wyniku działania enzymów proteolitycznych nastepuje rozerwanie wiązań kazeiny, bedacej czynnikiem stabilizującym ukłąd koloidalny mleka. Odsłoniete łańcuchy alfa-kazeiny reaguja z jonami wapnia i tworzy się skrzep podpuszkowy—wytrąca się parakazeina wapnia. Rozkład cząsteczki kazeiny pod wpływem podpuszczki, jej stężenia, temperatury i kwasowości roztworu.

Po oddzieleniu serwatki masa serowa jest solona i poddawana dojrzewaniu. Isnieje bardzo wiele róznych gatunków serów dojrzewających.

Sery miękkie: formowanie, ocieranie, solenie, osuszenie i dojrzewanie.

Sery twarde i półtwarde: płukanie, dogrzewanie, dosuszanie, formowanie, osuszenie i dojrzewanie

Produkty fermentacyjne przerobów feta:

Ser feta jest produkowany z mieszanki pasteryzowanego mleka owczego z mlekiem kozim- to drugie stanowi tylko 5-10% owej mieszanki. Niedozwolone jest używanie środków konserwujących lub koloryzujących.

Należy do grupy serów miękkich o zawartości tłuszczu ok. 40%.

Jest serem kruchym, dobrze topiącym się w wysokiej temperaturze.

Kultury starterowe - zestaw bakterii inicjujący fermentacje mlekową:

Przetwory mleczne:
-kefir (S. lactis, S. cremoris, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus),
-jogurt (S. thermophilus, L. bulgaricus),
-kwaśna śmietanka (S. lactis, S. cremoris).

Sery:
-twarde typu cheddar (S. lactis, S. cremoris),
-twarde z gęstwy wysoko-dogrzewanej (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus),
-półtwarde i miękkie z gęstwy nisko-dogrzewanej (Leuconostoc cremoris, S. lactis, S. cremoris),
-miękkie typu camembert i brie (P. camemberti, P. candidum),
-miękkie, maziowe (Brevibacterium linens),
-miękkie typu roquefort (P. roqueforti).

Kultury startowe hodowane są zwykle na pożywce sporządzonej z mleka w proszku, wolnego od antybiotyków. Hodowlę prowadzi się najczęściej do początku fazy stacjonarnej. Szczepionki czystych kultur dostarczane są do zakładów mleczarskich w postaci płynnej, wysuszonej, zamrożonej lub koncentratów bakteryjnych.

Szczepionki płynne są to kultury namnożone i natychmiast po inkubacji i schłodzeniu rozsyłane do odbiorców. Podczas transportu następuje osłabienie aktywności drobnoustrojów i dlatego kulturę uaktywnia się przez kilkakrotne przeszczepienie zanim zostanie wykorzystana do produkcji.

Popularna metoda przechowywania kultur drobnoustrojów jest w postaci liofilizowanej. Czynnik krioochronny dodawany jest bądź do pożywki przed hodowlą, bądź do płynu po hodowli. Po osiągnięciu fazy stacjonarnej płyn jest zobojętniany i szybko zamrażany do temperatury -20°C, -30°C. Liofilizację prowadzi się w temperaturze nie przekraczającej 30°C.

Stosuje się również przechowywanie kultur startowych w postaci zamrożonej. W temperaturze -20°C do -40°C można przechowywać zamrożone drobnoustroje do trzech miesięcy.

13. METODY MODYFIKACJI GENETYCZNEJ DROBNOUSTROJÓW W ASPEKCJE BIOTECHNOLOGICZNYM

BIOTECHNOLOGIA A OGM

W przypadku hodowli komórek zwierzęcych i roślinnych, komórki rosną w warunkach sztucznych: nie wewnątrz tkanki, ale oddzielone od niej. Wymaga to specjalnych technik i dbałości gdyż komórki takie są bardzo wrażliwe na środowisko.

Hodowle komórek roślinnych.

W odróżnieniu od zwierzat, rozliny stanowią organizmy o znacznie mniejszem stopniu skoordynowania róznych organów i tkanek, dzieki czemu mozna stosunkowo łatwo otrzymywac hodowlę tkanek roslinnych in vitro, a także otrzymywac z hodowli tkankowych, jak i z pojedynczych komórek rośliny.

Zdolnośc komórek roślinnych do dzielenia się i odtwarzania całego organizmu okresla się mianem totipotencji. Stanowi ona głównych sukcesach i zastosowaniach hodowli komórek roślinnych.

Totipotencja - zdolność do odtwarzania całego organizmu z 1 komórki somatycznej, w której zawarta jest cała informacja genetyczna.

Pożywki stosowane do hodowli komórek roślinnych są prostsze od tych stosowanych do hodowli komórek zwierzęcych. Zawierają one sole nieorganiczne, źródła węgla i azotu oraz różne hormony roślinne. Skład pożywek ma duży wpływ na rozwój tkanki kalusowej oraz hodowlę komórek w zawiesinie.

Różnice w hodowli komórek roślinnych i bakteryjnych:
-rośliny rosną wolniej (20-40 h) niż bakterie (0,5 h),
-bakterie wykazują większe zapotrzebowanie na tlen niż rośliny,
-rośliny są bardziej wrażliwe na mieszanie niż bakterie,
-do wzrostu bakterie potrzebują energię chemiczną (cukry), natomiast rośliny słoneczną (fotosynteza),
-komórki roślinne są znacznie większe (20-100 μm ) niż bakterie (0,2-1 μm),
-lokalizacja metabolitów wtórnych u bakterii jest zewnątrzkomórkowa, u roślin wewnątrzkomórkowa.

Zastosowanie:
-badanie metabolizmu komórkowej, w tym mechanizmów biosyntezy białek,
-określanie wpływu poszczególnych substancji (inhibitorów) oraz czynników fizycznych,
-obserwacja mutacji,
-wykorzystanie metabolitów: fitohormony, alkaloidy, sterydy.

Hodowle komórek zwierzęcych.

Hodowle komórek zwierzęcych polegają na kultywowaniu wyodrębnionych komórek pochodzących z tkanek lub płynów ustrojowych.

Pojedyncze komórki uzyskuje się w wyniku mechanicznego, chemicznego lub enzymatycznego rozdrobnienia odpowiedniej tkanki. Tak uzyskane komórki noszą nazwę kultury pierwotnej. Komórki wyodrębnione z kultury pierwotnej i przeniesione do świeżej pożywki noszą nazwę kultury wtórnej. Operację przenoszenia komórek do świeżego medium można powtarzać wielokrotnie, uzyskując linie komórkową. Zwykle wzrost kultury wtórnej jest ograniczony i po pewnym czasie zanika.

W hodowli komórek zwierzęcych stosowane są dwie techniki: na stałym nośniku i wgłębna. Niektóre komórki, tzw. powierzchniowo zależne, rosną na powierzchni fazy stałej tworząc monowarstwę. Komórki te wymagają stałego nośnika. Znane te są komórki zdolne do wzrostu w roztworze, podobnie jak bakterie. Dla tego typu komórek można stosować hodowle wgłębną.

Podstawowe znaczenie dla hodowli komórek zwierzęcych ma pożywka, w której prowadzona jest hodowla. Podstawowe składniki pożywki to:

-osocze, zwykle jest to osocze cielęce w ilości 5-10%. Jest to bardzo drogi składnik pożywki. Osocze spełnia kilka funkcji: chroni komórki przed uszkodzeniami mechanicznymi, stymuluje podział komórek, stymuluje zaczepianie komórek do podłoża w przypadku komórek powierzchniowo zależnych, dostarcza niektórych składników, np. globuliny, hormonów;

-roztwór odżywczy zawierający glukozę, aminokwasy, witaminy i sole
mineralne;

-dodatki, głównie antybiotyki chroniące przed infekcją bakteryjną lub
grzybową, np. penicylina przeciw bakteriom Gram-dodatnim, nystatyna
przeciw grzybom, gentamycyna lub tetracyklina przeciw mykoplazmom.

Zastosowanie:

Pierwsze na skale techniczną hodowle komórek zwierzęcych przeprowadzono w 1962 roku, a zastosowanie przemysłowe datuje się na 1967 rok(produkcja szczepionek przeciwko pryszczycy). Obecnie hodowle komórek zwierzęcych stosowane są do wytwarzania wielu produktów:

-produkcja szczepionek wirusowych (opryszczki, polio),
-produkcja interferonów, przeciwciał monoklonalnych, hormonów (hormonu wzrostu),
-diagnostyka wirusów, badania nad rakiem

- badaniach podstawowych w biologii

Produkcja szczepionek wirusowych:

Ważnym obszarem wykorzystania hodowli komórek zwierzęcych jest produkcja szczepionek przeciwko chorobom wirusowym.

Szczepionki otrzymuje się w wyniku hodowli komórek pierwotnych uzyskiwanych przez trypsynizację tkanek lub z hodowli linii komórek diploidalnych.

Namnożone komórki zaraża się wirusem. Po lizie większości komórek, dalszej obróbce poddaje się płyn pohodowlany. Wirusy poddaje się inaktywacji, dezaktywacji lub rozczepieniu, w zależności od rodzaju szczepionki.

Otrzymywanie roślin transgenicznych - pierwsze rośliny transgeniczne uzyskano w 1983 roku (tytoń, petunia).

Wybór odpowiedniego genu - izolacja i klonowanie genu do wektora.

Stworzenie konstruktu genowego:
-sekwencje regulacyjne - odpowiedzialne za funkcjonowanie genu (promotor, terminator),
-gen markerowy - odpowiedzialny za selekcje stransformowanych komórek (odporności na antybiotyki, herbicydy),

-gen reporterowy - odpowiedzialny za wczesne wykrycie stransformowanych komórek (białko zielone GFP).

Transformacja w kultur in vitro - wprowadzenie genu do protoplastów, z których łatwo jest zregenerować rośliny.

Sprawdzenie obecności wprowadzonego DNA:
-PCR (wykrycie śladowych ilości DNA),
-Southern Blot (wykrycie DNA za pomocą sondy oligonukleotydowej),
-Northern Blot (wykrycie transkrypcji genu poprzez wykrycie mRNA za pomocą sondy oligonukleotydowej).

Metody uzyskiwania nasion transgenicznych:

Metody bezpośrednie (bezwektorowe):
-mikroiniekcja - bezpośrednie wprowadzenie DNA do jąder protoplastów (wydajność 15-25%),
-elektroporacja - wprowadzenie DNA do protoplastów za pomocą krótkich impulsów elektrycznych, które powodują powstawanie porów w błonie, przez które DNA (w formie linearnej) wnika do wnętrza komórki, (wydajność 2-8%),
-metoda chemiczna - inkubacja protoplastów z plazmidowym DNA w obecności jonów magnezu i glikolu polietylenowego, który obniża napięcie powierzchniowe błony komórkowej, umożliwiając wnikniecie DNA do komórki, (wydajność 0,1-12%

Metody pośrednie (wektorowe):
-za pomocą Agrobacterium tumefaciens oraz Agrobacterium rhizogenes (jedynie roślinny dwuliścienne).

Wprowadzenie DNA do roślin- metody bezpośrednie

-fuzja protoplastów - odpowiednim enzymem usuwana jest ściana komórkowa a następnie wykorzystywany jest glikol polietylowy , który przenika przez błonę plazmatyczną przenosząc DNA.

-mikrobombardowanie - za pomocą " armatki " wstrzeliwuje się mikroskopijne cząsteczki wolframu lub złota pokryte przez DNA do nienaruszonych komórek roślinnych.

-efektory chemiczne - protoplasty wraz z DNA , glikolem polietylowym , poliaminami , jonami magnezu lub wapnia inkubuje się. Tworzy się konglomerat czyli otoczony DNA odporny na nukleazy który przenika błonę cytoplazmatyczną .

-za pomocą liposomów - DttA inkubuje się z liposomami w obecności odpowiedniego bufory 9 następnie wprowadza do protoplastów .

-elektroporacja - wprowadzenie bardzo dobrze oczyszczonego DNA przy użyciu generatora prądu (impuls elektryczny rozluźnienia ścianę komórkową)

-mikroiniekcja - wprowadzenie DNA do liści, zarodków, merystemów czy nasion przy użyciu mikrostrzykawki lub mikropipety

-infiltracja - materiał roślinny wprowadza się do naczynia z którego wysysa się powietrze, następuje mechaniczne mikroskopijne rozerwanie ścian, porowanie błon i plazmid zostaje wessany do wnętrza komórki.

-za pomocą silikonowych włókien węglanowych

Efekty genetycznego doskonalenia roślin:

Jabłka- odporność na insekty

Banany- odporność na wirusy i grzyby

Kawa- lepszy smak i aromat

Kukurydza- odporność na insekty

Ziemniaki- odporność na wiele zakażeń

Pomidory- odporność na zakażenia wirusowe

Pszenica- odporność na herbicydy

Wykorzystanie roślin transgenicznych.

Odporność roślin na herbicydy - stosowanie nieselektywnych, ulegających biodegradacji herbicydów do zwalczania chwastów.

Odporność roślin na choroby i szkodniki:
-jabłka, kukurydza (geny z B. thuringensis, endotoksyny) - odporność na insekty,
-banany (geny chitynaz rozkładają ścianę komórkową) - odporność na grzyby.

Tolerancja roślin na stres abiotyczny (zagospodarowanie nieużytków rolnych):
-gen tolerancji na wysokie zasolenie pochodzący z namorzynów umożliwia stworzenie roślin transgenicznych.

Podniesienie zawartości odżywczych i smakowych roślin:
-ryż (wykorzystując geny żonkila) - nadprodukcja beta-karotenu, prekursora witaminy A,
-kawa - obniżona zawartość kofeiny oraz lepszy aromat,
-winogrona - odmiany bezpestkowe,
-truskawki - odmiany mrozoodporne,
-pomidory - lepszy kolor i zapach, dłuższy czas dojrzewania i mięknięcia,
-słonecznik - zmniejszona zawartość kwasów tłuszczowych.

Powiększenie spektrum barw roślin ozdobnych:
-petunia - wprowadzenie genu dihydroflawonolu z kukurydzy znacznie poszerzyło paletę barw tych kwiatów.

Bioreaktory:
-tytoń - produkuje somatotropinę,
-lucerna (gen z B. licheniformis) - produkuje alfa-amylazę,
-rzeżucha i rzepak - produkują plastik, ulegający biodegradacji.

Nawozy bakteryjne - szczepionki zawierające bakterie wiążące azot atmosferyczny:
-azotobakteryna (Azotobacter): kapusta (o 33%), pomidory (o 28%), ziemniaki (o 30%), burak cukrowy i kukurydza (o 15%),
-nitragina (Rhizobium): lucerna (o 40%), groch i soja (o 15%), łubin i koniczyna (o 10%).

Produkcja szczepionek w roślinach transgenicznych:
-izolacja genu kodującego białko antygenowe mikroorganizmu chorobotwórczego,
-gen klonowany do wektora (A. tumefaciens) oraz transformacja genetyczna,
-roślina transgeniczna wytwarzająca białko antygenowe mikroorganizmu chorobotwórczego,
-rozmnażanie klonalne roślin transgenicznych - szczepionka roślinna,
-izolacja i oczyszczanie antygenu oraz tradycyjne szczepienie lub immunizacja poprzez bezpośrednią konsumpcję.

Argumenty za GMO:

Tworzenie nowych gatunków i odmian.

Wzbogacenie walorów smakowych, zapachowych, odżywczych.

Poprawa stanu środowiska naturalnego (transgeniczne bakterie, całkowita utylizacja odpadów).

Terapia genowa (walka z nowotworami oraz wrodzonymi anomaliami genetycznymi).

Ludzka insulina, hormon wzrostu produkowane jest na skalę przemysłową przez odpowiednio zmienione szczepy E. coli.

Drożdże produkujące szczepionki przeciw wirusom zapalenia wątroby (badania nad szczepionkami przeciwko AIDS).

Sondy genetyczne (pozwalają wcześnie wykryć szereg chorób dziedzicznych np. fenyloketonurię i anemię sierpowatą).

Produkcja ludzkich organów.

Argumenty przeciw GMO.

Nadprodukcja żywności (konkurencja cenowa, bezrobocie)
.

Przekazywanie odporności chwastom.

Niszczenie różnorodność.

Nie można zachować nasion do wysiania w następnym roku (kontrola korporacji nad rolnictwem, nasiona patent).

Problem stabilności genów, trudne do określenia skutki uboczne i zagrożenia

Zakazy prawne, moralne i kulturowe.

---