CCF20091118003

Biologia nowotworzenia - Ćwiczenie 5 i 6

Molekuły kolagenu będące bogate w aminokwasy zasadowe, silnie reagują z barwnikami kwaśnymi. Czerwień syriuszowa jest silnym kwaśnym barwnikiem, który zawiera sześć grup sulfonowych. Barwi ona włókna kolagenowe reagując swymi grupami sulfonowymi z aminokwasami kolagenowymi. Wydłużone molekuły barwnika otaczają włókno w ten sposób, że ich długie osie są do siebie równoległe. Ten równoległy związek pomiędzy barwnikiem a kolagenem objawia się zwiększoną dwójłomnością [Junąueira i wsp., 1982; Nielsen i wsp., 1997], Cztery grupy chromoforowe w każdej molekule czerwieni syriuszowej są odpowiedzialne za wysoki współczynnik ekstynkcji tego barwnika, który to pozwala na odnalezienie niewielkich ilości kolagenu na skrawkach, a także w elektroforetycznym żelu akrylamidowym na tyle istotne, że możliwe jest wykrycie 5,76 jug kolagenu w 1 mg białka [Nielsen i wsp., 1997],

Niestety dziś autorzy wielu prac podkreślają niespecyficzność czerwieni syriuszowej. Zaznaczają oni, że obecność substancji innych niż kolagen musi zostać uwzględniona, gdy przeprowadza się jego analizę ilościową. Nielsen i wsp. [1997] wykazali, że czerwień syriuszowa może być wiązana przez inne białka niż kolagen, a mianowicie - przez białka zawierające duże ilości aminokwasów zasadowych. Elastyna, obecna obok kolagenu w skórze właściwej, nie zawiera dużej ilości aminokwasów zasadowych [Kłyszejko-Stefanowicz, 1995], więc w przypadku skóry jest to barwienie o dosyć wysokiej specyficzności. Poza tym spośród wszystkich dostępnych barwników kolagenu czerwień syriuszowa charakteryzuje się najwyższą specyficznością, a możliwość obserwacji preparatów w świetle spolaryzowanym podczas analizy ilościowej umacnia tylko jej pozycję.

W naszym opracowano ilościową metodę analizy obrazów, pozwalającą na ilościową ocenę zawartości włókien kolagenowych, która jest obiektywna, stosunkowo szybka i nieskomplikowana. Zakładzie. Przeprowadzone dotychczas badania dotyczące oceny zawartości włókien kolagenowych w preparatach parafinowych łagodnych i złośliwych zmian barwnikowych skóry człowieka wykazały, że:

- wraz z rozwojem czerniaka następuje zmniejszenie zawartości kolagenu

- w brzegach zmian barwnikowych i zdrowej skórze otaczającej zmianę nie obserwuje się wyraźnych zależności między zawartością włókien kolagenowych i stopniem rozwoju czerniaka

- w centrum czerniaków stwierdzono mniej kolagenu w porównaniu z centrami łagodnych znamion barwnikowych.

- nie stwierdzono zależności pomiędzy zawartością włókien kolagenowych a wartością parametru diagnostycznego R.

3.1. Barwienie preparatów parafinowych czerwienią syriuszową

Do analizy służą preparaty parafinowe zmian barwnikowych skóry człowieka o grubości 5 lim. przygotowane według standardowych procedur histopatologicznych.

Odparafmowanie preparatów [Inoshita i Youngberg, 1982]

1. Ogrzewać preparaty parafinowe w 56°C - 30 minut

2. Po wyjęciu preparatów parafinowych z cieplarki odparafinować je w czystym ksylenie:

* I ksylen - 20 minut,

* II ksylen - 20 minut.

2. Uwodnić preparaty w alkoholu etylowym o malejącym stężeniu:

* alkohol 99,80%- 15 minut,

* alkohol 70,00%- 15 minut,

* alkohol 50,00%- 15 minut.

3. Umieścić preparaty w wodzie bidestylowanej -3x10 minut.