CCF20121026006

Odczynniki

Hemoglobina (masa cząsteczkowa 68 kDa)

0,2% błękit metylenowy (masa cząsteczkowa 320 Da)

Sephadex G-25 20 mmol/1 NaOH

Wykonanie oznaczenia

Kolumnę chromatograficzną o wymiarach 12-15 cm wysokości i 1 cm średnicy wypełnić wcześniej przygotowanym żelem typu Sephadex G-25 i przelać roztworem NaOH (około 50 ml). Następnie na powierzchnię żelu nałożyć 0,2-0,3 ml mieszaniny zawierającej hemoglobinę i błękit metylenowy (1:1). Po nałożeniu próbki, przez kolumnę przelać 50 ml NaOH, zbierając równocześnie frakcje o objętości 1 ml (przy szybkości wypływu z kolumny 2 ml/minutę, co odpowiada elucji 1 kropli/2-3 s. Przy przechodzeniu przez kolumnę solwentu obserwuje się szybki rozdział hemoglobiny od błękitu metylenowego. Jako pierwsze zbiera się frakcje zawierające hemoglobinę, a następnie frakcje z błękitem metylenowym.

28