cw2 5

Warunki ogólne: ^.przebiegu całej analizy wymagane jest zachowanie warunków aseptycznych i stosowanie wyłącznie materiałów pozbawionych endotoksyny bakteryjnej. Reakcja odczynnika LAL H endotoksyną zależy od pH środowiska, pH mieszaniny w próbie powinno nucwii. filo* w przedziale od 6,5 do 8,0. Próby należy przechowywać zamrożone w temp. -2§?fc lub niższej. Nie-należy prób (ekstraktów) wielokrotnie zamrażać i rozmrażać, gdyż wpływa to na pomiar stężenia endotoksyny w roztworze.

Oznaczanie:

Pj2£h|jte 0,1 ml każdej próby pa dno dołka <np..yv płytce 96 dołkowej) wg ustalonego wcześniej protokołu (tabeli). Jednocześnie przeprowadzić na płytce kalibrację z dwoma próbami ślepymi i w ośmiu punktach (5-8 pkt) w zakresie od 0,05 EU/ml do 50 EU/ml. Dodatkowo w oznaczeniach należy umieścić próbki kontrolne z dodatkiem wzorca lub bez wzorca, jako pozytywną i negatywną kontrolę.

Ustawić temperaturę w czytniku mikropłytkowym na 37°C Hł°C.. Pipetą wielokanałową szybko dodać 0,1 ml LAL, rozpoczynając od blanku i negatywnej kontroli a kończąc na próbie z największym stężeniem endotoksyny. Nastawić automatyczne mieszanie w czytniku. Wykonać pomiar: turbidymetiyczny lub kinetyczny i uruchomić program do analizy wyników. Odczyt kinetyczny, optymalny, w komputerze należy prowadzić tak aby największa szybkość reakcji mogła być użyta do określenia stężenia endotoksyny. W odczycie kinetycznym można użyć do określenia stężenia endotoksyny czasu jaki jest potrzebny do uzyskania absorbancji OD=0,2. Pomiar należy przeprowadzać przynajmniej w dwóch powtórzeniach, zalecane są 3.