img285

82 Dorota Hoja-Łukowicz

Chromatografię powinowactwa stosuje się do:

-    oczyszczania substancji ze złożonych biologicznych mieszanin,

-oddzielania fonny natywnej od zdenaturowanej danej substancji,

-    oddzielania małych ilości materiału biologicznego od dużych ilości substancji balastowych.

Ligand po związaniu z podłożem nie traci swojego specyficznego powinowactwa wiązaf niowego do danego substratu lub grupy substratów. Przykładami „ligandów grupowych” mogą być NAD* i AMP, które wiążą więcej niż jeden enzym, lub konkanawalina A wykazująca powinowactwo do niektórych reszt cukrowych.

Najczęściej stosowane układy biologiczne w chromatografii powinowactwa:

enzym:

przeciwciała:

lektyna:

kwasy nukleinowe:

hormon, witamina: komórka:

analog substratowy, inhibitor, kofaktor antygen, wirus, komórka

polisacharyd, glikoproteina, receptor powierzchni komórkowej, komórka

komplementarna zasada, histon, polimeraza kwasu nukleinowego, białko wiążące receptor, białko nośnikowe

specyficzne białko powierzchni komórkowej, lektyna

Ligand powinien spełniać następujące warunki:

-    wykazywać specyficzne i odwracalne powinowactwo wiązaniowe dla danej substancji, która ma być oczyszczona;

-    posiadać grupy modyfikowalne chemicznie, co pozwoli na przyłączenie go do podłoża bez niszczenia jego aktywności wiązaniowej;

-    posiadać powinowactwo do substancji wiążącej w przedziale 10 ⁴ - 10 ^a M w stanie wolnym w roztworze. Jeśli stała dysocjacji jest niższa niż około 10 * M, to elucja tak związanej substancji bez jej inaktywacji jest bardzo trudna;

-jeśli ligand posiada różne grupy funkcyjne, którymi może być przyłączony do nośnika, to powinien on być sprzęgnięty z nośnikiem poprzez grupę wykazującą najmniej specyficzne oddziaływanie z izolowaną molekułą;

-    grupy funkcyjne Uganda biorące udział w specyficznym oddziaływaniu muszą się znajdować w wystarczającej odległości od nośnika, aby nie wystąpiły przeszkody steryczne interakcji ligand - izolowana molekuła.

Ze względu na ostatni warunek, zachodzi czasem konieczność przyt\vierdzęniąjjgąndą.dq nośnika poprzez tzw. „odstępnik”. Najczęściej odstępnikami są łańcuchy węglowodorowe zawierające od dwu do dziesięciu atomów węgla. Mają one szczególne znaczenie w przypadku ligandów o bardzo malej cząsteczce, wiążących wielkocząsteczkowe substancje, lub też wtedy, gdy dana substancja wykazuje niewielkie powinowactwo do zastosowanego liganda. Długość odstępnika jest niezwykle ważna, gdyż przy zbyt krótkich odstępnikach oddziaływanie ligand - izolowana molekuła jest mało efektywne. Natomiast bardzo długie odstępniki mogą wiązać różnorodne substancje z próbki na zasadzie oddziaływań hydrofobowych. Pojawienie się niespecyficznych oddziaływań obniża selektywność rozdziału.

Podłoże powinno spełniać następujące'warunki!

-    zapewniać stabilność pod względem fizycznym i chemicznym w warunkach eksperymentu (wysokie i niskie pH, detergenty, rozpuszczalniki organiczne);

-    napełnione nim kolumny muszą posiadać odpowiednią przepuszczalność;

-    musi być wolne od efektów adsorpcji niespecyficznej.

Zastosowanie chromatografii powinowactwa immunologicznego...

83

Powyższe warunki spełniają podłoża agarozowe lub mikroskopijne perełki szklane pokreślonej porowatości. Stosuje się również celulozą, poliakrylamid oraz usieciowane dekstrany. Podłożem o najszerszym zastosowaniu jest Śefaroza 4B - jest to usieciowana agaroza (-D-galaktozo-3,6-anhydro-L-galaktoza-). Struktura otwartych porów (limit filtracji żelowej 'wynosi MW 20* 10⁶) czyni wnętrze tego podłoża dostępnym do przyłączenia liganda i zapewnia dużą pojemność wiązaniową nawet dla dużych molekuł. Formasi ec i o w a żeluzapewnia do-skonały przepły w z minimalnym wchodzeniem wJkanafy a to z kolei ułatwia szybki rozdział, Nośniki jako substancje niereaktywne muszą zostać zaktywowane chemicznie, aby można było przyłączyć do nich odpowiednie ligandy, np. grupy hydroksylowe nośników cukrowych (agaroza, dekstran, celuloza) aktywowąnę sąb rpm oc yjan em ((IŚBl^z utworzeniem grup kar-boimidowych:

OH

OH

+ CNBr

t-o

^>C=NH

Z kolei grupy karboimidowe tak zaktywowanego nośnika reagują z grupami aminowymi liganda (np. białkowego), tworząc pochodne izomocznika:

i	— 0 —C—NH —
i

NH

podłoże    ligand

Etapy chromatografii powinowactwa

W celu osiągnięcia jak najlepszego rozdziału stosuje się adsorbenty o wysokiej pojemności, krótkie kolumny oraz wolny przepływ linearny eluentu.

-    Szybkość przepływu

jiOwyiJcm ²/h

Aby uzyskać ostry profil krzywej elucji, a jednocześnie maksymalny odzysk z minimalnym rozcieńczeniem rozdzielanych substancji, należy stosować.dogi^zczalmej gajwojniejsza szybkość.przępływu. Cząsteczki substancji związanej z ligandem są w równowadze z cząsteczkami tej substancji w stanie wolnym. Eluent współzawodniczy o wolne molekuły z unieruchomionym ligandem. Przy silnym powinowactwie szybkość elucji jest ograniczona, dlatego powinno się stosować powolną elucję. Natomiast przy słabym powinowactwie zastosowanie wolnego przepływu szczególnie ważne jest przy nakładaniu próbki, aby umożliwić zajście oddziaływania między ligandem a oczyszczaną molekułą. W chromatografii powinowactwa stałe dysocjacji ligand - substancja oczyszczana mieszczą się w szerokim przedziale wartości, dlatego nie jest możliwe określenie optymalnej szybkości przepływu. Chociaż w publikacjach spotyka się linearną szybkość przepływu 100 ml/cm^J/h, to jednak nie zaleca się przekraczania wartości 10ml/cm²/h.

-    Nakładanie próbki

Próbka powinna być rozpuszczona w buforze wyjściowym. Jeśli oddziaływanie ligand -oczyszczana substancja jest silne, to objętość nakładanej próbki nie ma znaczenia. Natomiast słabo wiążące się substancje należy nakładać na kolumnę w małej objętości (około 5% objętości żelu) w celu uniknięcia współelucji z materiałem niezaadsorbowanym. Siedzenie roz-