img282

76 Dorota Hoja-Łukowicz

Redukcja kwasu fosfomolibdenowego zachodzi szybko w środowisku o pH 10, jednakże przy tym pH kwas fosforomolibdenowy jest nietrwały i ulega hydrolizie do kwasu fosforowego i molibdenowego. Dlatego po dodaniu odczynnika Folina badaną próbkę należy szybko i dokładnie wymieszać.

15.1.1.1.    Materiały    ,

Próbka - roztwór albuminy surowicy wolowej (BSA) o stężeniu w przedziale 10-100 pg/ml; roztwór wzorcowy białka (BSA) o stężeniu 1 mg/ml

15.1.1.2.    Aparatura i sprzęt laboratoiyjny

Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, pipety nastawne, czasomierz 15.1.1.5. Odczynniki

0.9% NaCl, IN NaOH, odczynnik węglanowy (1 ml 2% winianu sodowo-potasowego + 1 ml 2% CuS0₄ + 98 ml 2% Na₂C0₅; przygotować bezpośrednio przed użyciem), odczynnik Folina-Ciocalteu (odczynnik powinien mieć barwę żółtą; powinien być przechowywany w ciemnej butelce i chroniony przed zanieczyszczeniami związkami organicznymi).

15.1.1.4.    Wykonanie

Do 0.1 ml badanej próbki dodać 0.1 ml IN NaOH oraz 1 ml świeżo przygotowanego odczynnika węglanowego (mieszać w trakcie dodawania). Próbkę pozostawić na 15 minut. Następnie dodać 0.1 ml świeżo rozcieńczonego odczynnika Folina-Ciocalteu (rozcieńczać wodą destylowaną w stosunku 1:2; np.: 2 ml odczynnika Folina-Ciocalteu + 4 ml H,0). W trakcie dodawania odczynnika energicznie mieszać. Próbkę pozostawić na 30 minut w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Absorbancję odczytać wobec próby kontrolnej (0.1 ml 0.9% NaCl zamiast roztworu białka). Równolegle, posługując się roztworem wzorcowym, wykonać krzywą kalibracyjną, używając stężeń od 0 do 100 pg białka w 0.1 ml próbki.

Uwaga: Oznaczenie ilościowe białka wykonać w trzech równoległych powtórzeniach.

15.1.1.5.    Opracowanie wyników

Na papierze milimetrowym wykreślić krzywą kalibracyjną (zależność absorbancji od stężenia białka) i wyznaczyć stężenie białka z trzech równoległych powtórzeń oraz obliczyć średnie stężenie białka w badanej próbce.

15.1.2.    Oznaczanie stężenia białka .w próbce metodą Bradforda

Zasada: Wiązanie Coomassie Brillant.Blue£-250 do białka powodujejgntesunijciejnaksh rnum absorbancjjz 465 do 595 nm. Pojawiająca się barwa jest trwała od 2 minut do 1 godziny, przy czym optymalny czas pomiaru zawiera się między piątą a dwudziestą minutą po dodaniu odczynnika Bradforda.    t-mVt

Zalety: Duża czułość metody oraz szybkie wykonanie oznaczenia. Metoda ta umożliwia oznaczenie białka już w stężeniu 0.4 pg/ml roztworu.

Wady: Poszczególne białka dają różne natężenie barwy z odczynnikiem Bradforda, należy więc stosować odpowiednie wzorce białkowe.

Aceton oraz detergenty, takie jak: siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100, znacznie zwiększają natężenie barwy. Nieznaczne pogłębienie barwy powodują silne zasady.

15.1.2.1.    Materiały

Próbka - roztwór białka (BSA) o stężeniu w przedziale 1-25 pg/ml

15.1.2.2.    Aparatura i sprzęt laboratoryjny

Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, pipety nastawne

15.1.2.3.    Odczynniki

Roztwór wzorcowy (BSA) o stężeniu białka 1 mg/ml, odczynnik Bradforda (100 mg Coomas-sie Brillant Blue G-250 rozpuszczono w 50 ml 95% etanolu. Dodano 100 ml 85% kwasu ortofosforowego i dopełniono H₂0 dest. do 1000 ml), 0.15 M NaCl.

15.1.2.4.    Wykonanie

100 pl roztworu wzorcowego rozcieńczyć H_;0 dest. w stosunku 1:1 i pobrać do kolejnych probówek 0; 10; 20; 30; 40 i 50 pil, przy czym uzupełnić 0.15 M NaCl do objętości 50 pil. Do oddzielnej probówki pobrać 50 pl próbki o nieznanym stężeniu białka. Do wszystkich probówek dodać po 2.5 ml odczynnika Bradforda, wymieszać i po 5 minutach odczytać wartość absorbancji przy X = 595 nm wobec ślepej odczynnikowej.

Uwaga: Oznaczenia stężenia białka w badanej próbce wykonać w trzech równoległych powtórzeniach.

15.1.2.5.    Opracowanie wyników

Na papierze milimetrowym wykreślić krzywą kalibracyjną (zależność absorbancji od stężenia białka) i wyznaczyć stężenie białka z trzech równoległych powtórzeń. Obi iczyć średnie stężenie białka w badanej próbce.

15.1.3. Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna

Spektrofotometria jest oparta na prawie Lamberta-Beera,.które wiąże pochłaniane promieniowanie z ilością (stężeniem) cząsteczek absorbujących i mówi, że równoległa wiązka promieniowania monochromatycznego ulega osłabieniu przy przejściu przez roztwór substancji absorbującej:

(O    A = log(l₀/l) = log(l/T) = kcl ,

gdzie: A- wartość absorpcji (absorbancja, ekstynkcja, gęstość optyczna) roztworu.

I„- natężenie pierwotnej wiązki światła,

I - jej natężenie po przejściu przez roztwór badany,

1 - grubość warstwy absorbującej, k - współczynnik absorpcji właściwej, c - stężenie roztworu,

T - przeźroczystość lub przepuszczalność (transmitancja) ośrodka.