img283

78 Dorota Hoja-Łukowicz

.Współcżyhinikik j est wielkością charakterystyczną dla danej substancji absorbującej, stalą dla danej długości fali i równą liczbowo wartości absorpcji roztworu o stężeniu jednostkowym i jednostkowej grubości warstwy.

Roztwory białek wykazują charakterystyczne maksimum absorpcji w zakresie UV przy długościach fali od.2^0 .do. 2.9,0,jjm (zwykle odczytu absorbancji dokonuje się przy X = .2,80 nip) co wynika z obecności aminokwasów aromatycznych (Tyr, Trp, i’he). Umożliwia to oznaczenie stężenia białek w roztworach. W tym samym zakresie UV absorbują również inne związki, głównie kwasy nukleinowe i nukleotydy. W roztworze białka położenie maksimum absorbancji UV zależy od pH roztworu białka oraz zawartości w nim reszt Tyr, Trp i Phe.

W zmodyfikowanej metodzie spektrofotometrycznej stężenie białka w próbce określa się na podstawie różnicy absorbancji mierzonych przy długościach fali 235 i 280 nm:

(2)    stężenie białka (mg/ml) = (A_JJS - A_2!0)/2.51

gdzie: współczynnik 2.51 jest różnicą pomiędzy średnią wartością współczynnika ekstynkcji (E^0J%) w 235 i 280 nm.

Zalety: Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna umożliwia określenie stężenia białka w próbce bez korzystania z odnośnika białkowego i krzywej kalibracyjnej; eliminuje wkład kwasów nukleinowych w wartość mierzonej absorbancji (kwasy nukleinowe dają tę samą absorbancję przy 280 i 235 nm); jest niezależna od specyfiki składu aminokwasowego białka; pomiaru absorbancji przy wymienionych dwóch długościach fali można dokonać w tej samej próbce.

Wady: Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna wykazuje 45% czułości metody Low-iy’ego. Dla białek o specyficznym składzie aminokwasowym konieczne jest wykonanie krzywej kalibracyjnej.

15.1.3.1.    Materiały

Próbka - 1 ml roztworu białka (BSA) o stężeniu w przedziale 1 - mg/ml

15.1.3.2.    Aparatura i sprzęt laboratoryjny Spektrofotometr, kuweta kwarcowa o pojemności 1 ml

15.1.3.3.    Wykonanie

Zmierzyć wartość absorbancji badanej próbki przy długościach fali 235 i 280 nm.

15.1.3.4.    Opracowanie wyników

Korzystając ze wzoru (2), obliczyć stężenie białka w badanej próbce.

15.1.4.    Określanie aktywności enzymatycznej białka

Według zaleceń Komisji Enzymatycznej z 1961 roku jednostką standardową enzymu ozna¹-czoną symbolem f (ang.S®) jest taka jego ilość, która katalizuję przemianę 1 rnikromola sujt-stratu,(lub 1 mikromola odpowiednich grup chemicznych) w .ciągu_1 minuty w warunkach optymalnych (w środowisku o stężeniu jonów wodorowych, w którym enzyrnwykazuje mak-symalną.aktywność i w obecności.wszystkich potrzebnych kofaktorów,w odpowiednich stężę-niach) przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu i w temperaturze 30°C (miano:;jpmoVmit§. Stopień czystości preparatów enzymatycznych określa aktywność właściwa, tzn. liczba jednostek standardowych przypadająca na 1 mg białka (J/mg). Dla maksymalnie oczyszczonych homogenicznych preparatów można wyznaczyć aktywność molekularną, tj. liczbę cząsteczek substratu przekształconych w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu w warunkach optymalnych. Wielkość tę można wyrazić liczbą jednostek standardowych przy-padającąna 1 mikromol enzymu (J/pmol). Posiada ona miano 1/min (ponieważ J wyraża się w pmol/min).

Według zmian Komisji Enzymowej Międzynarodowej Unii Biochemicznej z 1972 roku, jednostką enzymatycznąjest ta aktywność enzymu, która przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy. Jednostkę tę nazwano katalerii;(k'ąt); jej mianem jest mol/s, a pochodnymi sąmi-krokatal (10 ^ć kat) i nanokatal (10~⁹ kat). Aktywność właściwą wyraża się w mikrokatalach na kilogram białka (pkat/kg). Zależność liczbowa między starymi i nowymi jednostkami jest następująca:

lkat = 1 mol/s = 6 • 10⁷ J 1 J = 1 pmol/min = 16 • 67 ■ 10 ⁹ kat

15.1.4.1.    Materiały

Frakcja lizosomowa wątroby 3-miesięcznych szczurów

15.1.4.2.    Aparatura i sprzęt laboratoryjny

Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, łaźnia wodna, czasomierz, pipety nastawne

15.1.4.3.    Odczynniki

Bufor octanowy (0.3 M CH₃COONa/CH₃COOH pH 4.5), substrat (3 mM (3-D-glukuronid fenoloftaleiny), stoper (0.5 M glicyna-NaOH pH 10.4)

15.1.4.4.    Wykonanie

Przygotować 10-, 50- i 100-krotne rozcieńczenia frakcji lizosomowej wątroby szczura. Z każdego rozcieńczenia odpipetować do oddzielnych probówek po 30 pi każdej próbki, dodać 100 pl buforu octanowego pH 4.5 i 30 pl substratu. Inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut. Reakcję enzymatyczną zatrzymać, dodając 0.8 ml stopera. Stężenie przekształconego substratu mierzyć w specolu przy X = 555nm i k = 884 wobec ślepej odczynnikowej. Odczyt ten jest wyrażony w nmol/ml. Po uwzględnieniu czasu inkubacji i przeliczeniu go na 1 s otrzymujemy nkatale.

Uwaga: Oznaczenia aktywności P-glukuronidazy wykonać w 2 równoległych powtórzeniach.

15.1.4.5.    Opracowanie wyników Obliczyć aktywność enzymu w nkat.