PCR (5)

przyłączania niż pozostałe należy dołączyć do ich końców t/w. klamrę, czyli ciąg 4-5 cylo-zyn, aż do podwyższenia temperatury do żądanej.

końce poszczególnych starterów i otrzymywanych sekwencji nie mogą być komplementarne, koncentrację każdej pary starterów należy dobierać indywidualnie, nic powinna być jednak większa niż 0,4 pM (dla każdego ze starterów), zbyt duża koncentracja jednej z par zahamuje amplifikację pozostałych fragmentów, zbyt mała koncentracja nic pozwoli na otrzymanie żądanego produktu (Uwaga! nie należy przetrzymywać starterów zmieszanych ze sobą.), dcoksynukleozydotrifosforany (dNTP) używane w reakcji powinny być jak najrzadziej odmrażane, ponieważ tracą wtedy swoją wydajność już po pierwszych 10 cyklach reakcji, powszechnie stosowana koncentracja każdego z nich to 200 uM.

-    w mieszaninie reakcyjnej w celu poprawienia wydajności amplifikacji powinna być zwiększona koncentracja chlorku magnezu (1,5 mM MgC’l_?).

jeśli wydajność poiimerazy jest sprawdzona, to nic ma potrzeby zwiększać ilości tego enzymu, 1 u/25 ul mieszaniny reakcyjnej jest całkowicie wystarczająca,

czas syntezy powinien być nieznacznie wydłużony (2-3minuty), ale temperatura obniżona do 65-68*C\

-    reakcję należy wykonywać w obecności kontroli pozytywnej i negatywnej (bez. DNA).

2    3    4    5

Rysunek 5. Elcktroforcgram produktów PCR (1-5), które będij amplifikowane w jednej reakcji multipleks PCR agaroza dwuproccutowa (fot. Z. Nowak)

Na rysunku 6 z lewej strony widoczne są trzy różne matryce DNA wykorzystane w reakcji ampliłi-kacji. Do mieszaniny reakcyjnej dodano jednocześnie 4 pary starterów (oznaczone strzałkami), specyficzne do czterech różnych regionów (każdy region oznaczony innym kolorem). W zależności od liczby rozpoznanych miejsc amplifikuje się różna liczba fragmentów widoczna w żelu (z prawej strony).

Rysunek 6. Schemat reakcji multipleks PCR

— 31 —