0000012 3

Poznanie konstrukcji przestrzennej cząsteczki DNA pozwalało wyprowadzić kilka istotnych wniosków, co do sposobu kodowania informacji genetycznej i strategii jej powielania:

1.    Dość oczywistym stało się. że informacja zawarta iest w kolejności ułożeni? nykleotYdÓw (por. później ROZDZ: 3):

2.    Łatwo można było wyobrazić sobie, iż kopiowanie (powielanie, podwajanie) DNA może polegać na rozdzielaniu obu nici cząsteczki macierzystej i dosyntetyzowaniu do nich nowych, zgodnie z zasadą komplementarności. W ten sposób replikacja stałaby się bardzo wierna (kopie byłyby identyczne z cząsteczką macierzystą).

REPLIKACJA PROWADZI DO PODWOJENIA ILOŚCI DNA

Tak więc fascynująca zagadka budowy ..cząsteczki życia" została rozwikłana, byl to jednak dopiero początek drogi biologii molekularnej. Jednym z kolejnych, ważnych etapów było wykazanie, jak w rzeczywistości przebiega replikacja. Powstało bowiem kilka konkurencyjnych modeli wyjaśniających ten sam proces. Wszystkie one zakładały, że matrycą dla tworzenia nowych łańcuchów DNA stanowiła ..stara", macierzysta cząsteczka (por. Ryc. 9). Różnica polegała na sposobie wykorzystania matrycy. I tak model:

Ryc. 9. Różne modele replikacji: a — konserwatywnej, b — przypadkowej, c — scmikonserwaiywnej.

A)    replikacji konserwatywnej (zachowawczej) — zakładał, że w czasie kopiowania nie dochodzi do rozpleccnia podwójnej spirali cząsteczki macierzystej i w związku z tym. z dwóch dwuniciowych cząsteczek DNA powstałych po replikacji, jedna jest nienaruszoną („starą”) cząsteczką macierzystą, druga zaś tworzona jest w całości przez dwie „nowe", zsyntetyzo-wanc nici potomne (por. Ryc. 9 a):

B)    replikacji przypadkowej zakładał, że dochodzi do rozpleccnia i fragmcntacji podwójnej spirali cząsteczki macierzystego DNA. Następnie dojcdnoniciowych fragmentów dosynte-tyzowanc byłyby komplementarne nici. po czym następowałoby scalanie ich w nowe. W obu cząsteczkach DNA powstałych po replikacji występowałyby zarówno nowe jak i stare fragmenty (we wszystkich niciach: por. Ryc. 9 b);

C)    replikacji semikonserwatywnej (półzachowawczcj) zakładał, że obie nici macierzystej cząsteczki DNA są matrycą dla nowej, dwuniciowej cząsteczki (to akurat nie było niczym nowym!). W takim sposobie kopiowania dochodziłoby do rozpleccnia podwójnej spirali cząsteczki macierzystej, jednak bez rozkładu jcdnoniciowych łańcuchów na mniejsze fragmenty. Następnie do każdej ze „starych” nici dosyntetyzowane byłyby nowe. W związku z tym, każda z dwóch dwuniciowych cząsteczek DNA powstałych po replikacji miałaby jedną nienaruszoną („starą”) nić. druga zaś byłaby całkow icie nowa (coś jak: fifty—fifty). Słuszność tego sposobu powielania DNA postulowali Watson i Crick (por. Ryc. 9c).

O tym, który z teoretycznych modeli jest słuszny, rozstrzygnęły pomysłowe doświadczenia Matthew Mcsclsona i Franklina Stahla z 1957 r. Badacze ci opracowali bardzo „sprytną" (pomysłową) metodę oddzielania i rozróżniania „starych" i „nowych" cząsteczek DNA. Meselson i Stahl zaczęli od tego, że wyhodowali dwie kultury bakteryjne Eschericliia coli:

1.    Pierwsza rozwijała się na podłożu zawierającym „typowy" izotop azotu — ^,JN:

2.    Druga rozwijała się na podłożu zawierającym „ciężki” izotop azotu — ^,5N.

Jak zapewne doskonale wiesz, azot jest istotnym składnikiem zasad azotowych, a więc badane bakterie wbudowywały odpowiednie izotopy do syntetyzowanych zasad azotowych, a później do DNA. Należało więc oczekiwać, że DNA bakterii zawierający izotop ’'N będzie nieznacznie cięższy niż ten z izotopem ^IJN. Różnice te można stwierdzić wykorzystując metodę wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu. Brzmi to groźnie, ale mimo skomplikowanych szczegółów technicznych metoda ta wykorzystuje ten sam „chwyt”, który stosowali np. poszukiwacze złota w USA w XIX w. Zapewne Ty także z. zapartym tchem (?) oglądałeś westerny barwnie obrazujące bohaterów dzikiego zachodu. Niektórzy z nich. mimo niewątpliwych braków w wychowaniu i edukacji, potrafili znaleźć i pozyskać złoto ze „złotonośnych" strumieni. Nieliczni z nich mieli dość rozumu, aby wykorzystać zdobyty majątek w odpowiedni sposób, ale chyba zaczynam pisać nie tę książkę. Porzućmy więc te grafomańskic zapędy i spójrzmy na sprawę bardziej z naukowego punktu widzenia. Istotna dla nas była technika oddzielania złota od ± piasku wykorzystująca różnice w ciężarze właściwym złota i piasku. Nabraną na patelnię porcję złotonośnego podłoża zanurzali w wodę, po czym wprawiali w ruch wirowy. Lżejsze składniki mieszaniny porywane były przez prąd wody, złoto zaś osadzało się na dnie. Opadanie składników mieszaniny pod wpływem grawitacji lub siły odśrodkowej to sedymentacja.

W przypadku oddzielania drobin złota i piasku problem jest niezbyt skomplikowany technicznie, ponieważ różnią się one bardzo znacznie masą i gęstością. Rozdzielanie cząsteczek DNA jest znacznie trudniejsze. Dlatego Meselson i Stahl posłużyli się zdecydowanie czulszą metodą. Mianowicie, wirowali wypreparowane DNA w roztworze doskonale rozpuszczalnej soli — chlorku cezu. Rozpuszczalność tej ostatniej pozwala bardzo precyzyjnie dobrać gęstość roztworu, tak aby była ona zbliżona do gęstości DNA. Jeśli teraz umieścić specjalną probówkę w szybkiej wirówce, to długotrwałe wirowanie spowoduje, że cząsteczki soli będą przemieszczały się w stronę dna probówki, tak więc gęstość roztworu stanie się najmniejsza przy jego powierzchni i będzie rosła w stronę dna. Podobny ..los" spotka DNA — lżejsze cząsteczki z ..normalnym izotopem iłifotu ulokują się bliżej powierzchni, natomiast te z ciężkim izotopem, bliżej dna.

Wróćmy teraz do naszych modeli. Jeśli replikacja miałaby charakter konserwatywny, to po jednej rundzie replikacyjnej rozkład DNA po wirowaniu powinien być taki jak na Ryc. 10 A a. Jak widzisz, należałoby oczekiwać, że połowę DNA stanowiłaby lekka frakcja „starego" DNA, Połowę zaś ciężka „nowego” DNA. Jeśli model taki byłby słuszny, należało oczekiwać więc, że gdy dojdzie do dwóch rund replikacji (dwóch cykli podziałowych komórek E. coli) to: zasadniczo ^cz'vartą część DNA stanowiłaby frakcja ciężka „starego" DNA. natomiast 3/4 stanowiłby lekki

23