0000029(2)

GENETYKA

KAJAK). Określenie sekwencja palindromowa bierze się siad. ze ułożenie nukJeotydów jednej nici takiego odcinka jest takie samo jak drugiego, tylko odczytywanego w kierunku odwrotnym (por. sekwencje na Ryc. 125).

Jeśli enzym restrykcyjny tnie DNA w każdym miejscu, które pasuje doń przestrzennie, to powstaje problem, jak spowodować ażeby nie niszczył DNA swojego właściciela. Możliwe tu są dwa rozwiązania:

A)    nie ..stosować” we własnym DNA takich sekwencji. Biorąc pod uwagę niewielką długość obszarów restrykcyjnych i ograniczenia wynikające z natury kodu genetycznego, nie jest to możliwe. Pozostaje więc:

B)    modyfikowanie chemiczne niektórych zasad we własnych, wrażliwych odcinkach tak, żc restryktazy nie będą ich rozpoznawać. Wymaga to posiadania odpowiednich enzymów, które komórki bakteryjne oczywiście posiadają. Skoro takich modyfikacji nie ma w DNA bakteriofagów, istnieje możliwość pocięcia informacji genetycznej „wroga" na mniejsze fragmenty, które zostaną później zdegradowane.

Enzymy restrykcyjne można podzielić na takie, które:

1.    Zostawiają tzw. tępe końce (por. Ryc. 125 a). Z punktu widzenia inżynierii genetycznej nie są przydatne, ponieważ nie dają możliwości odpowiedniego łączenia powstających fragmentów;

2.    Zostawiają tzw. lepkie końce (por. Ryc. 125 b, e). Takie enzymy rozcinają palindromowy obszar restrykcyjny, tworząc na obu powstałych końcach jednoniciowe, komplementarne odcinki liczące kilka nukleotydów. Właściwość ta jest niesłychanie ważna, ponieważ ieśli podziałamy ta sama restryktaza na dwie różne cząsteczki DNA, to otrzymamy fragmenty, które beda miały identyczne, lepkie końce. Wówczas może dojść do:

A)    odtworzenia pierwotnego układu odcinków DNA;

B)    powstania zrekombinowanego DNA składającego się / fragmentów o różnym pochodzeniu.

Oczywiście pełne odtworzenie struktury dwuniciowej wymaga stosowania jeszcze ligaz. stąd proces łączenia różnych DNA nazywa się tutaj ogólnie ligacją.

a

b

c

•    • •• G T T^?A AC--••••CA A_aT T G • • • •

•    • • -G^? A A T T C - - - -----C T T A A_aG

•    • • -A^ł A GCTT------T T C G A₄A

Ryc. 125.

Przykłady działania enzymów restrykcyjnych: a —pozostawiający ..tępe" końce enzym Hna I. h — pozostawiający ..lepkie" końce enzym Eco Rl. c — pozostawiający ..lepkie" końce enzym Hind III (nazw enzymów oraz sekwencji przez nie rozcinanych nie musisz znać!).

LEPKIE KOŃCE UMOŻLIWIAJĄ NATURALNE L ICZENIE Sit; FRAGMENTÓW DNA RÓŻNYCH ORGANIZMÓW

Tak więc dysponując technikami wybiórczego fragmentowania i łączenia DNA. można wyizolować żądany gen i umieścić go w innej cząsteczce DNA. Dzisiaj znanych jest już kilka tysięcy

różnych rcstryktaz i od potowy lat 90-tych wicie / nich można po prostu kupić w firmach biotechnologicznych.

KLONOWANIE DNA MOŻNA PRZEPROWADZAĆ NA ROŻNE SPOSOBY

W inżynierii genetycznej osiągnięcie sukcesu wymaga zastosowania szeregu różnych doświadczeń pomocniczych oraz prób zasadniczych z użyciem wielu komórek. Niezbędne do tego jest dysponowanie wieloma kopiami danego genu, które uzyskuje się przez klonowanie DNA. czyli powielanie określonego odcinka w licznych, identycznych kopiach. Przeprowadza się to dwojako:

1.    In vivo wprowadzając wyizolowany gen do komórki bakteryjnej, która dzieląc się szybko daje ogromną ilość komórek potomnych (zawierających interesujący nas gen). Procedury temu towarzyszące są w sumie dość czasochłonne i kosztowne;

2.    In \ ttro przy wykorzystaniu tzw. techniki PCK (reakcji łańcuchowej poi i me razy, od an g.poly-merase choin reoction). Ta niesamowicie „sprytna⁷’ metoda pozwala na bardzo szybkie namna-żanie określonego odcinka DNA w probówce. W dużym uproszczeniu technika PCR polega

na:

A)    rozdzieleniu nici interesującego nas fragmentu DNA w podwyższonej temperaturze;

B)    obniżeniu temperatury i dołączeniu do obu nici sztucznie zsyntctyzowanych starterów (por. replikacja w ROZDZ: 2.2):

C)    dodaniu polimerazy DNA. która replikuje każdą z nici.

Cykl ten powtarza się „w kółko", a jego skutkiem jest wykładniczy wzrost ilości cząsteczek DNA. Metoda PCR wymaga jednakże stosowania specjalnej polimerazy DNA, odpornej na działanie wysokich temperatur. Enzym ten pozyskuje się z bakterii Thermus aąuaticus żyjącej w gorących źródłach w temp. ok. 90 C. Poza tym niezbędne jest szybkie i precyzyjne sterowanie zmianami temperatury. Dzisiaj stosuje się już specjalne, sterowane mikroprocesorami urządzenia pozwalające w pełni zautomatyzować cały proces.

UWAGA: Metodę PCR można też stosować do namnażania RNA.

WPROWADZENIE GENU DO KOMÓRKI WYMAGA ZASTOSOWANIA ODPOWIEDNIEGO WEKTORA

Niezależnie od tego. czy będziemy przeprowadzać klonowanie, czy też próbowali umieścić gen w komórce docelowej, niezbędne będzie połączenie go z wektorem. Wektor jest czymś w rodzaju opakowania umożliw iaiaccgo przenoszenie DNA z tednei komórki do drugiej. Rolę wektorów pełnią najczęściej (por. też ROZDZ: 4.3):

1.    Plazmidy— jak zapewne pamiętasz te małe. koliste cząsteczki DNA replikują się niezależnie od genomu gospodarza, mogą też zawierać specyficzne geny umożliwiające wtckombinowanie wprowadzonego DNA do chromosomu gospodarza (± biorcy). Przeniesienie plazmidów, np. między komórkami bakterii, można osiągnąć osłabiając ich ściany komórkowe;

2.    Bakteriofagi —szczególnie użyteczne są tutaj fagi. które integrują się z genomem gospodarza. Daje to, podobnie jak w przypadku niektórych plazmidów, możliwość włączenia przenoszonego DNA do genomu gospodarza.

221