0
0

(1300xg przez 15 min), usunąć supernatant, zebrać warstwę interfazową zawierającą krwinki białe, przenieść ją do świeżej probówki i wirować tak jak poprzednio. Ponownie zebrać warstwę interfazową.

c) Ekstrakcja DNA:

1.    W probówce o pojemności 1,5 ml umieścić rozdrobnione 25-50 mg tkanki stałej lub zawiesinę interfazową z 1-1,5 ml krwi i dodać 750 gl buforu ekstrakcyjnego (odcz. 1).

2.    Dodać 20 (ii proteinazy K i mieszać przez powolne obracanie probówki.

3.    Inkubować próbki w temp. 55°C przez co najmniej 3 godz. (najlepiej 12 godz.). Dodać 750 pl mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 3). Mieszać łagodnie zawartość probówki do chwili powstania emulsji.

4.    Odwirować (13000x0 w temp. pokojowej przez 30 min). Przenieść górną warstwę wodną do innej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 75 pl 4 M octanu amonu (odcz. 4) i 750 pl izopropanolu (odcz. 5) i umieścić w lodzie na 30 min dla wytrącenia DNA.

5.    Odwirować (13000x0 w temp. pokojowej, 30 min).

6.    Usunąć supernatant z probówki bacząc, aby nie naruszyć osadu DNA.

7.    Dodać 500 pl 70% roztworu etanolu i mieszać przez łagodne obracanie probówki. Odwirować (13 000 x 0 w temp. pokojowej przez 30 s).

8.    Powtórzyć etap 6. dotykając krawędzi probówki bibułą, aby przez działanie kapilarne usunąć jak najwięcej cieczy.

9.    Suszyć osad w temperaturze pokojowej 10-20 min.

10.    Rozpuszczać osad DNA w 100 pl buforu TE, przez co najmniej 12 godz. Uwagi:

1)    Jako tkanka stała szczególnie polecane są: grasica, serce, nerka, mózg, wątroba, trzustka.

2)    Jako antykoagulant zalecany jest roztwór ACD (citric acid - citrate - dextrose): 0,8% kwas cytrynowy - 2,2% cytrynian sodowy - 2,45% D-glukoza, szczególnie w przypadku DNA o dużej masie cząsteczkowej (Gustafson i wsp. 1987).

3)    Ze względu na stosunkowo małą wydajność w przypadku krwi mrożonej, aby poprawić efektywność, krew po rozmrożeniu można poddać działaniu trypsyny (Ahmad i wsp. 1995).

4)    DNA otrzymany tą metodą może być wykorzystany w podstawowych procedurach biologii molekularnej. Technikę tę opisano do zastosowania w probówkach do mikrowirówki, wobec czego przeprowadzano wytrącanie izopropanolem, aby zmniejszyć objętość cieczy do wirowania, jednakże w celu wytrącenia DNA można także użyć etanolu, który trzeba dodać w 2-krotnie większej objętości.

5)    Fenol jest substancją silnie żrącą i mutagenną, co wymaga zachowania środków ostrożności w postaci rękawic i okularów ochronnych. Miejsca kontaktu skóry z fenolem powinno się spłukiwać dużą ilością wody i zmywać mydłem. Nie należy w tym celu posługiwać się etanolem.

6)    Jako wyjściowego powinnno się używać fenolu w postaci bezbarwnej i przejrzystej cieczy, przechowywanej w temp. — 20°C. Stosowanie fenolu krystalicznego nie jest polecane ze względu na konieczność jego rekrystalizacji w temp. 140°C, dla

370