04

octowego, inkubowanych w temp. 25-35^cC przez 15 godz. Powstały barwny roztwór wykazuje maksimum absorbancji przy ). = 600 nm. Chemiczna natura powstającego kompleksu barwnego nie jest znana. Stosowanie klasycznej metody Burtona nie pozwala na oznaczanie ilości DNA w ciągu jednego dnia. Przedstawiona modyfikacja tej metody oferuje skrócenie czasu inkubacji do 3 god/. przez podniesienie temperatury do 50°C. Przy takim postępowaniu barwa roztworu nie ulega zmianie po upływie 3 godz., co pozwala na pomiar stężenia DNA w wielu próbkach w czasie jednego dnia. W przeciwieństwie do opisanej w ćw. 10.33 metody oszacowania ilości DNA przez pomiar absorpcji w świetle UV. technika oparta na reakcji z difenyloaminą jest specyficzna dla DNA, a nie dla DNA i RNA.

Materiał: Roztwór DNA.

Odczynniki:

1)    DNA, np. z grasicy bydlęcej (cieląt), do wykonania roztworu wzorcowego.

2)    0,005 M roztwór NaOH.

3)    I M roztwór HC10₄.

4)    0,5 M roztwór HCI0₄.

5)    Difcnyloamina.

6)    CH₃COOH lodowaty.

7)    Stężony H₂S0₄.

8)    1,6% roztwór aldehydu octowego.

Wykonanie:

1.    Sporządzenie wzorcowych roztworów DNA: stosując DNA (odcz. 1) przygotować roztwór o stężeniu 0,15 mg/ml przez rozpuszczenie DNA w NaOH (odcz. 2) do uzyskania stężenia 0,3 mg/ml, a następnie rozcieńczenie go w stosunku 1:1 kwasem chlorowym (VII) (odcz. 3) i ogrzewanie w temp. 70°C przez 15 min; do sporządzania krzywej wzorcowej pobierać objętości roztworu zawierające: 3, 6, 9, 15, 30 i 60 pg DNA.

2.    Sporządzić odczynnik difenyloaminowy przez dodanie 1,5 g difenyloaminy, 100 ml CH3COOH lodowatego, 1,5 ml stężonego H₂S0₄ i 0,5 ml aldehydu octowego.

3.    Doprowadzić objętości próbek DNA wzorcowych i badanych do 0,5 ml przez dodanie 0,5 M roztworu HC10₄.

4.    Do każdej probówki dodać 1 ml odczynnika difenyloaminowego sporządzonego według przepisu podanego w etapie 2.

5.    Inkubować w temp. 50^CC przez 3 godz.

6.    Odczytać absorbancję próbek przy ż = 600 nm, sporządzić krzywą wzorcową i na jej podstawie ocenić ilość DNA w próbkach badanych.

Uwagi:

1)    Metoda ta pozwala na wykrycie 3 pg DNA.

2)    Roztwór wzorcowy sporządzony według procedury opisanej w etapie 1 powinien być przechowywany w temperaturze — 20°C.

3)    Odczynnik difenyloaminowy (etap 2.) należy sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

434