0 9

hybrydyzację prowadzić w temp. 42°C przez 2 godz., a następnie dodać tyle /denaturowanej sondy molekularnej (denaturacja w temp. 95^CC przez 5 min i gwałtowne oziębienie do 0°C), aby osiągnąć jej stężenie 2 ng/ml. Proces hybrydyzacji prowadzić w temp. 42°C przez 20 godz., a następnie błonę żelową kilkakrotnie wypłukać odczynnikiem 9 (temp. 60°C).

7. Autoradiografia. Ekspozycję 24-godzinną błony żelowej po hybrydyzacji prowadzić wobec filmu rentgenowskiego w kasecie z ekranem wzmacniającym. Obraz iiutoradiogramu porównać z obrazem rozdziału fragmentów restrykcyjnych po wybarwieniu bromkiem ctydyny — żel po etapie 4. powyższej procedury (rys. 10.17).

Ćwiczenie 10.45. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu kodującego /?-aktynę w komórkach różnych linii hodowlanych metodą hybrydyzacji typu Northern blotting

|J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboraiory manuał. Book 1. Cold Spring llarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 7.39 7.52)

Zasada: Intensywność syntezy mRNA /j-akiyny jest we wszystkich komórkach organizmu ssaków' bardzo podobna. Gen kodujący to białko nie ulega amp-lifikacji, a jego aktywność transkrypcyjna jest znaczna i nie wykazuje różnic tkankowozależnych. Stąd też izolując RNA z dowolnej tkanki czy hodowlanej linii komórkowej najpierw' analizuje się go pod względem zawartości mRNA dla jtaktyny. Jest to pozytywny test kontrolny, wskazujący na prawidłowy przebieg procedury otrzymywania RNA. (Biorąc pod uwagę podatność tego kwasu nukleinowego, szczególnie mRNA, na degradację przez wszechobecne rybonukleazy, sprawdzian jakości otrzymanego RNA jest zawsze wskazany przed przystąpieniem do dalszych jego analiz), ^-aktyna stanowi także referencyjny transkrypt w ilościowych oznaczeniach syntezy innych mRNA w komórkach określonego materiału badawczego. Pomiary transkryptu dla fł-aktyny prowadzi się metodą hybrydyzacji typu Northern blotting albo coraz częściej stosowaną techniką ilościowego RT--PCR (podrozdz. 10.3.5).

Materiał! Całkowity RNA wyizolowany z: prawidłowych limfocytów B człowieka, z komórek linii bialaczkowej HL-60 oraz linii wyprowadzonej z komórek nowotworowych raka jelita grubego LS180 - roztwory o stężeniu 6 pg RNA/pl w wodzie traktowanej DEPC — silnym inhibitorem RNaz (patrz ćw. 10.12).

Odczynniki:

1)    Sonda molekularna znakowany digoksygeniną antysensowny RNA aktynowy (firmy Boehringer Mannheim); roztwór wodny o stężeniu 10 pg RNA/nil.

2)    5 x bufor elekcroforctyczny (tj. 5xstężx>ny) do żeli zawierających formaldehyd: 0.1 M bufor MOPS [3-(iV-morpholino)propane sulfonie acid kwas 3-(.V-morfolino)propanosulfonowy] (pH 7.0) - 40 mM CHjCOONa - 5 mM EDTA (pH 8.0).

3)    Bufor obciążający: 50% glicerol - ImM EDTA (pH 8.0) - 0,25% błękit bromofcnolowy - 0,25% cyjanoksylen.

4)    Standardowy bufor hybrydyzacyjny z formamidem: 5 x SSC - 50% formamid - 0.1% laurylosar-kozynian sodowy - 0.02% SDS - 2% odczynnik blokujący (firmy Boehringer Mannheim).

5)    DIG Lumincsccnt Detection Kit firmy Boehringer Mannheim.

l naj>a: Wszystkie roztwory stosowane podczas elektroforezy, blotowania i hybrydyzacji powinny być przegotowane na wodzie traktowanej DEPC, a cały sprzęt wymyty detergentami i wypłukany wodą .DEPC-owaną”.

459