09

Elucję izokratyczną prowadzić za pomocą 50 mM KH₂P0₄ zawierającego 5% roztwór metanolu (odcz. 13), z szybkością przepływu eluentu 1 ml/min. Zapis chromatogramów rozpocząć w momencie nastrzyknięcia próbki na kolumnę i zakończyć po 15 min w przypadku chromatografowania wzorców i po 50 min podczas chromatografowania hydrolizatu DNA.

12. Zarejestrowane chromatogramy zintegrować i wykreślić krzywą kalibracyjną do oznaczeń dt oraz 5-Me-dC (krzywa zależności powierzchni szczytu od ilości wzorcowego związku naniesionego na kolumnę). Sposób przygotowania krzywych pokazano rys. 10.15. Z chromatogramów związków wzorcowych odczytać charakterystyczny czas retencji (R,) dC oraz 5-Me-dC i posługując się nim zidentyfikować szczyty obu związków na chromatogramie hydrolizatu DNA. Na rysunku 10.14 przedstawiono przykładowe chromatogramy uzyskiwane w trakcie rozdziału hydrolizatów DNA przygotowanych według opisanej procedury. Znając powierzchnię szczytów obu związków odczytaną z chromatogramu hydrolizatu DNA, obliczyć ilość nanomoli dC oraz 5-Me-dC w 20 pl hydrolizatu DNA, posługując się przygotowanymi krzywymi kalibracyjnymi. Obliczyć stopień metylacji 2'-deoksycytydyny wyrażony w procentach: stopień metylacji dC = (ilość nmol 5-Me-dC/ilość nmol dC) -100%.

Uwagi:

1)    Do wykonania etapu 1. należy bezwzględnie założyć okulary i grube rękawice ochronne.

2)    Etap 3. prowadzi do mechanicznego rozdrobnienia zawiesiny tkanki i uwolnienia zawartości komórek do buforu homogenizacyjnego. Mieszanina kwasu HEPES (•Y-hydroksyetylo-l-piperazyno-2-etano-sulfonowego) i jego soli sodowej jest buforem zapewniającym pH 7,4, optymalne dla zachowania całych jąder komórkowych. Ochronie tych jąder przed uszkodzeniem służą również zawarte w buforze mannitol i sacharoza, utrzymujące odpowiednią lepkość i ciśnienie osmotyczne buforu.

3)    Uzyskany osad nie jest czystym osadem jąder, zawiera on również dużą ilość innych podstruktur komórkowych. Jeśli wirówka nie ma odpowiednich adaptorów do wirowania w jednorazowych probówkach polipropylenowych, wirowanie homo-genatu należy przeprowadzić w odpowiedniej probówce wirówkowej. Szczególną uwagę należy zwrócić na dokładne zrównoważenie rotora.

4)    Podczas inkubacji w etapie 5. dochodzi do lizy jąder pod wpływem laurynianu sarkozylu (detergent rozpuszczający błonę jądrową) i strawienia białek przez prona-zę, również tych zintegrowanych z kwasami nukleinowymi. Odpowiednie pH dla aktywności katalitycznej pronazy zapewnia mieszanina buforowa Tris/HCl. Obecny w buforze lizującym EDTA kompleksuje jony metali, przez co zabezpiecza kwasy nukleinowe przed hydrolitycznym działaniem komórkowych nukleaz zależnych od jonów' metali.

parametry szczytu to: 1) h — wysokość (długość odcinka między wierzchołkiem szczytu a przedłużeniem łinii podstawowej); 2) zakrcskowana powierzchnia szczytu — ograniczona od dołu przez przedłużenie linii podstawowej między odcinkiem poprzedzającym i następującym po szczycie; 3) R, - czas retencji wybaczany poprzez rzut prostopadły wierzchołka szczytu chromatograficznego na oś czasu chromatogramu

429