04 2

rr

3.    Aktywować celulozę przez, moczenie w roztworach: 10 mM EDTA (odcz. 1 przez I 5 min), NaOH (odcz. 2 przez 5 min) i 6-krotne płukanie w H₂0. Używając pesety l rozszerzyć krawędzie nacięcia i wsunąć w nie fragment DEAE-celulozy, bacząc, aby j nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

4.    Prowadzić elektroforezę pod napięciem dającym natężenie pola elektrycznego , 5 V/cm do momentu, w którym całe pasmo znajdzie się na fragmencie celulozy.

5.    Używając pęsety wyciągnąć celulozę i płukać ją w roztworze (odcz. 3), aby I pozbyć się kawałków agar ozy.

6.    Przenieść celulozę do probówki Eppcndorfa o pojemności 1,5 ml, napełnić I buforem do elucji (odcz. 4) i inkubować w łaźni wodnej (w temp. 65°C przez 30 min) Zwrócić uwagę, aby celuloza była przez cały czas zanurzona w buforze. Przenieść I ciecz do nowej probówki Eppendorfa, a celulozę zalać buforem (odcz. 4) i in- I kubować tak jak poprzednio. Połączyć ciecze z obydwu probówek.

7.    Ekstrahować eluat mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 5). I Przenieść fazę wodną do nowej probówki, dodać 0,2 objętości CH₃COONH₄ (odcz. I 6) i 2 objętości etanolu (odcz. 7) o temp. 4°C, pozostawić w temperaturze pokojowej przez 20 min.

8.    Odzyskać DNA przez odwirowanie (12000 xg w temp. 4^JC przez 15 min).

9.    Płukać DNA w 70% roztworze etanolu, suszyć na powietrzu i rozpuszczać w 3-5 g.1 buforu TE (odcz. 9).

Uwagi:

1)    Jeżeli odzyskiwany DNA ma być wolny od bromku etydyny, należy w inny sposób zlokalizować interesujące nas pasmo; można tego dokonać np. przez prowadzenie elektroforezy w sąsiednim paśmie z bromkiem etydyny, pamiętając, k obecność bromku zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%.

2)    Kiedy ilościowe odzyskiwanie DNA nie jest konieczne, opisaną metodę można znacznie uprościć stosując zamiast DEAE-celulozy bibułę (najlepiej Whatman 3MM). Po elektroforezie należy ją pociąć na jak najmniejsze kawałki i umieścić w probówce Eppendorfa o pojemności 0,5 ml, z otworem zrobionym np. rozgrzaną igłą. Probówkę tę, po odcięciu wieczka, trzeba umieścić w innej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować (20000 xg przez 20 s). Po wirowaniu DNA będzie się znajdować w niewielkiej ilości buforu na dnie drugiej probówki.

3)    Aby zmniejszyć uszkodzenia radiacyjne, powinno się stosować lampę emitującą długofalowe promieniowanie UV.

4)    Wycinając DEAE-celulozę należy używać rękawic.

5)    Jeżeli DNA ma być odzyskany z całej ścieżki (np. fragmenty genomowego DNA powstałe z trawienia enzymami restrykcyjnymi), nacięcie trzeba zrobić równolegle do kierunku ścieżki wzdłuż całej jej długości i włożyć długi pasek DEAE-celulozy w nacięcie, a następnie ułożyć tak żel względem elektrod, aby DNA mógł być elektroforetycznie wprowadzony na celulozę. Po elektroforezie usunąć celulozę, pociąć ją na kawałki i eluować DNA.

6)    Kawałki celulozy' można przechowywać kilka tygodni w sterylnej H₂0 w temp. 4°C.

7)    Nie należy używać większych kawałków celulozy niż jest to potrzebne, gdyż zmniejsza to efektywność elucji DNA.

444