04

kach: adeninę w 1 M roztworze H₂S0₄, deoksyguanozynę w 1 M roztworze mrówczanu amonu o pH 6,8, a cytozynę w 1 M roztworze H₂S0₄ oraz w 1 M roztworze mrówczanu amonu o pH 6,8.

Ćwiczenie 10.28. Oscylopolarograficzna charakterystyka DNA Zasada: Patrz ćwiczenie 10.27.

Materiał: Roztwór DNA z grasicy bydlęcej o stężeniu 200 pg w I ml roztworu 0.1 xSSC.

Odczynniki:

1)    Roztwór 0,1 xSSC: 10-krotnic rozcieńczony roztwór SSC (0,14 M NaCI w 0,014 M cytrynianie sodu).

2)    1 M roztwór HCOONH₄ o pH 6,8.

Wykonanie: Należy zbadać zależność głębokości wgięcia anodowego i katodowego od stężenia preparatu DNA natywnego i zdenaturowanego. Denaturację DNA przeprowadzić ogrzewając roztwór natywnego DNA o stężeniu 200 pg w 1 ml roztworu 0,1 x SSC (w temp. 100°C przez 10 min), a następnie szybko oziębić go w łaźni lodowej. Szereg rozcieńczeń DNA przygotować według tab. 10.3. Dla każdego stężenia DNA, podobnie jak w przypadku zasad azotowych, wykonać 4 6 zdjęć i wyliczyć średnią wartość głębokości wgięcia przy danym stężeniu.

Tabela 10.3. Zestawienie rozcieńczeń roztworu DNA badanego oscylopolarograficznie

Lp.	Stężenie DNA (Wt/ml)	Wzorzec DNA (ml)	Elektrolit podstawowy (ml)	H,0 (ml)
I	100	2,5	2,5	—
2	80	2,0	2,5	0.5
3	60	1,5	2,5	1.0
4	40	1,0	2.5	1.5
5	20	0,5	2,5	2.0

Ćwiczenie 10.29. Badanie metodą pulsopolarograficzną uszkodzeń strukturalnych DNA wywołanych muta genami chemicznymi (R. Wiaderkiewicz, Z. Walter 1990: Acta Untoersitatis Lodziensis,Folia Biochimica et Biophysica, 7:27 40)

Zasada: Insektycydy fosforoorganiczne są czynnikami mutagennymi. Po inkubacji in vitro uszkadzają natywną strukturę DNA. W doświadczeniu zbadano działanie DDVP [0,0-dimethyl-0-(2,2-dichlorovinyl)phosphate] — dimetylodichlorowinylo-fosforanu na DNA z grasicy. Pomiar przeprowadza się na pulsopolarografie z użyciem kroplowej elektrody rtęciowej. Warunki oznaczania: atmosfera azotu, 1 V/15 min, amplituda 50 mV, czas opóźnienia 2 s. Stężenie DNA 400 (.tg/ml w roztworze: 0,3 M HCOONH₄ - 0,1 M bufor fosforanowosodowy o pH 6,9. Pomiar pulsopołarograficznych szczytów II i III (patrz pełny opis metody).

Materiał: DNA / grasicy bydlęcej otrzymany metodą fenolową (patrz ćw. 10.1)

Odczynniki:

1)    Roztwór DNA (1 mg/ml) w 0,1 M buforze fosforanowosodowym (pH 6,9).

2)    0,2 M roztwór HCOONII₄ o pH 6,9.

414