04

Rys. 10.2. Widma absorpcyjne w UV molowych roztworów zasad purynowych i pirymidynowych w 0,1 M roztworze HC1

widma absorpcji zasad purynowych i pirymidynowych, a także ich nukleozydów i nukleotydów mają charakterystyczne maksima w zakresie 250-280 nm. Z tego też powodu bezpośrednia analiza widmowa mieszaniny tych związków nie pozwala oznaczać jej składników jakościowo ani ilościowo. Analiza taka jest możliwa dopiero po uprzednim rozdzieleniu poszczególnych składników przez chromatografię (bibułową, kolumnową) lub elektroforezę. Rozdzielone składniki wymywa się następnie z bibuły i mierzy absorbancję roztworu (eluatu) w zakresie maksymalnego pochłaniania danej substancji. W celu wyeliminowania wpływu zanieczyszczeń aminokwasami aromatycznymi na wartości absorbancji pomiar wykonuje się w dwu długościach fal: maksymalnego pochłaniania (A_max) oraz w 290 nm (dla uracylu, cytozyny i ich pochodnych w 300 nm) i w obliczaniu korzysta się z różnicy absorbancji (AA)

AA = AA_max — A_290(300)

Zawartość danego związku wylicza się porównując odczytaną wartość absorbancji z absorbancją roztworu wzorcowego o znanym stężeniu, oznaczoną w tym samym spektrofotometrze w identycznych warunkach:

c_x:AA_x = c_w:AA_w

gdzie: c_x — stężenie substancji oznaczanej, c_w — stężenie substancji wzorcowej, AA* = A_max —A_290(300) dla substancji oznaczanej, AA_W = A_max —A_290(300) dla substancji wzorcowej.

Często stężenie oznaczanych substancji wylicza się także korzystając z wyznaczonych doświadczalnie molowych współczynników absorpcji (e). Istnieje następująca zależność między e a absorbancją (A):

394