0
4

Ćwiczenie 10.5.

ranu sodowego)

Izolowanie DNA z pełnej krwi z użyciem chloranu (VII) (nadchlo-zamiast fenolu (L. Johns i wsp. 1998: Anal. Biochem., 180:276-278)

Zasada: Przedstawione w ćw. 10.1, 10.3 i 10.4 metody izolowania DNA do osiągnięcia pełnej efektywności wymagają długotrwałej inkubacji lizatów jądrowych z proteinazą K, w tym czasie DNA jest narażony na działanie nukleaz. Użycie fenolu stanowi zagrożenie podczas jego przygotowywania i stosowania, jak również stwarza problem pozbywania się go w sposób nie powodujący zanieczyszczenia środowiska. W tym ćwiczeniu DNA izoluje się bez użycia fenolu i bez długotrwałej inkubacji z proteinazą K, co oprócz uniknięcia warunków do degradacji przez nukleazy daje znaczne skrócenie całej procedury. W pierwszym etapie dokonuje się lizy komórek krwi, jąder komórkowych oraz trawienia białek jądrowych. Otrzymany preparat DNA poddaje się dalszemu oczyszczaniu.

Materiał: Krew.

Odczynniki:

1)    Bufor do lizy komórek: 0,32 M sacharoza - 10 mM Tris/HCI (pH 8,0) - 5 mM MgCl₂ - 1% Triton X-100.

2)    Bufor do lizy jąder komórkowych: 150 mM NaCl - 100 mM EDTA - 50 mM Tris/HCI (pH 8,0).

3)    10% roztwór SDS.

4)    Roztwór RNazy A o stężeniu 10 mg/ml.

5)    5 M roztwór NaC10₄.

6)    Mieszanina: chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 24:1).

7)    96% roztwór etanolu.

8)    70% roztwór etanolu.

9)    5 M roztwór CH₃COONa o pH 7,0.

10) Bufor TE o pH 7,5: 10 mM Tris/HCI - 1 mM EDTA.

Wykonanie:

1.    Krew pobierać na antykoagulant, np. ACD (ćw. 10.1).

2.    10 ml krwi dodać do 35 ml buforu do lizy komórek (odcz. 1) i inkubować w lodzie przez 10 min.

3.    Odwirować (1000x0 w temp. pokojowej przez 20 min), a otrzymany osad jąder komórkowych zawiesić w 9,8 ml buforu do lizy jąder (odcz. 2).

4.    Dodać 1 mg RNazy z roztworu (odcz. 4) i inkubować (w temp. 37°C przez 30 min).

5.    Dodać SDS (odcz. 3) do końcowego stężenia 1,5% i inkubować (w temp. 60°C przez 10 min).

6.    Natychmiast po inkubacji dodać 2,5 ml świeżo przygotowanego NaC10₄ (odcz. 5) i łagodnie wymieszać.

7.    Wprowadzić równą objętość mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 6) i ekstrahować pod wyciągiem 30 min. Odwirować (10000 x g w temp. 4°C przez 10 min). Przenieść fazę wodną do probówki o pojemności 50 ml.

8.    Dodać 2 objętości schłodzonego etanolu (odcz. 7) w celu wytrącenia DNA. Odzyskać DNA przez nawinięcie na cienką bagietkę, najlepiej wygiętą na końcu na kształt litery U. Przenieść DNA do buforu TE (odcz. 10) i inkubować (w temp. 4°C przez 30 min).

/

374