06

Ćwiczenie 10.36. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi (J. Sambrook i wsp, 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 3. Cold Spring Harbor La bora-tory Press, Cold Spring Harbor, 5.31-5.32)

Zasada: Posługując się do trawienia enzymami będącymi w handlu, należy przestrzegać informacji podawanych przez sprzedawcę. W przypadku braku takich informacji można postępować zgodnie z opisem ćwiczenia.

Jednostkę enzymu definiuje się zazwyczaj jako taką jego ilość, która kompletnie trawi 1 pg DNA w odpowiednim buforze i optymalnej temperaturze w objętości 20 pi w czasie 1 godz.

Materiał: Pro- lub eukariotyczny DNA.

Odczynniki:

1)    Enzym restrykcyjny wraz z buforem do trawienia; jeśli brak takiego buforu, można stosować bufor KGB (kalium glutamatc buffer).

2)    2 x bufor KGB (tj. 2 x stężony): 200 mM glutaminian potasu - 50 mM Tris/octan (pH 7,5) • 20 mM (CH₃COO)₂Mg - 100 pg/ml albumina / surowicy cieląt - I mM 2-merkaptoctanol.

3)    0,5 M roztwór EDTA (pH 8.0),

Wykonanie:

1.    Roztwór zawierający 0,2 1 pg DNA umieścić w probówce i dodać H₂0 do objętości 18 pl.

2.    Dodać 2 pl odpowiedniego buforu do trawienia (10 x stężonego); w przypadku braku takiego buforu można zastosować 2 x bufor KGB (odcz. 2). Wymieszać przez łagodne uderzanie probówki palcem.

3.    Dodać 1 2 jednostki enzymu restrykcyjnego. Wymieszać łagodnie uderzając palcem. Inkubować w optymalnej temperaturze przez wymagany czas.

4.    Zatrzymać reakcję przez dodanie EDTA (odcz. 3) do stężenia końcowego 10 mM. Uwagi:

1)    W przypadku stosowania większej ilości DNA opisaną procedurę powinno się przeskalować.

2)    Inkubację dla enzymów jEcoRI, ZtamHI i HindlU prowadzi się w temp. 37 C przez 1 godz.

3)    Strawiony DNA można poddać analizie na wiele sposobów, z których chyba najprostszym jest elektroforeza w żelu agarozowym.'Stosując DNA prokariotycznc i odpowiedni dobór enzymu, otrzymuje się kilka pasm odpowiadających fragmentom restrykcyjnym, podczas gdy preparat kontrolny (bez enzymu) daje tylko jedno pasmo; w przypadku DNA eukariotycznego w wyniku działania enzymu otrzymuje się zazwyczaj przesunięcie całego pasma odpowiadającego danemu DNA w stronę odpowiadającą mniejszej ruchliwości elektroforetycznej.

4)    Używając enzymu dającego w wyniku trawienia lepkie końce DNA, przed analizą fragmentów DNA należy je ogrzewać w temp. 65°C przez 5 min w celu zerwania wiązań wodorowych, jakie mogły się wytworzyć między komplementarnymi odcinkami lepkich końców.

5)    Każdy enzym restrykcyjny wymaga specyficznych warunków do osiągnięcia optymalnego trawienia, w szczególności buforu, który może zawierać różne stężenia

436