04

Ćwiczenie 10.12. Izolowanie RNA z krwi (Y. Zhang, J.J. Yunis 1995: Biotechniąues, 18:789-791)

Zasada: Ekstrakcję w tej metodzie przeprowadza się roztworem zawierającym izotiocyjanian guanidyny, który powoduje dezintegrację komórek krwi oraz hamuje działanie nukleaz, co pozwala na zachowanie integralności RNA. Opisana procedura jest szybka i nie wymaga stosowania drogich odczynników.

Materiał: Krew.

Odczynniki:

1)    Roztwór denaturujący o składzie: 6 M izotiocyjanian guanidyny - 0,75% sarkozyl - 0,0375% cytrynian sodowy.

2)    Mieszanina: fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1). Fenol powinien być nasycony buforem TE o składzie: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA i mieć pH 6,0.

3)    Mieszanina: chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 24:1).

4)    Glikogen.

5)    Izopropanol.

6)    n-butanol.

7)    3 M roztwór CH₃COONa (pH 5,2).

8)    96% roztwór etanolu.

9)    70% roztwór etanolu.

Wykonanie:

1.    Przygotować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 300 pi roztworu denaturującego (odcz. 1) i pobrać do niej 200 pl krwi. Wymieszać łagodnie, lecz dokładnie. Przepuścić mieszaninę przez strzykawkę z igłą (rozmiar 18, a następnie 21), aby zmniejszyć lepkość DNA.

2.    Mieszaninę ekstrahować 2-krotnie fenolem z chloroformem (odcz. 2), mieszając po pierwszej ekstrakcji przez 30-krotne odwrócenie, a po drugiej — wytrząsając energicznie na urządzeniu typu Vortex przez 15 s. Usunąć resztki fenolu, białek i innych zanieczyszczeń ekstrahując chloroformem (odcz. 3).

3.    Do 360-400 pl fazy wodnej dodać 20 pg glikogenu (odcz. 4) i równą objętość izopropanolu (odcz. 5), inkubować w temp. — 20°C przez 45 min. Odwirować (14000xg w temp. 4°C przez 15 min) i odrzucić supernatant.

4.    Rozpuścić osad RNA w 400 pl H₂0 i dodać równą objętość n-butanolu (odcz. 6). Ekstrahować przez łagodne wytrząsanie na urządzeniu typu Vortex przez 15-20 s.

5.    Do fazy wodnej dodać ¹/₁₀ objętości CH₃COONa (odcz. 7) i 2,5 objętości 96% roztworu etanolu. Odwirować (14000x0 w temp. 4°C przez 15 min).

6.    Osad RNA 2-krotnie łagodnie przepłukać schłodzonym do temp. — 20°C 70% roztworem etanolu i rozpuszczać w 20-40 pl H_zO.

Uwagi:

1)    Po pobraniu krwi do roztworu denaturującego można ją przechowywać w temp. 4°C przez 1-2 tygodni.

2)    Po ekstrakcji n-butanolem preparat RNA powinien być bezbarwny i wolny od inhibitorów reakcji PCR.

3)    Wydajność procedury wynosi ok. 1-5 pg RNA na 100 pl krwi.

384