07

Ćwiczenie 10.14. Jednoczesne izolowanie DNA i RNA z materiału biopsyjnego, kultur komórkowych, roślin i bakterii (U. Dóbbeling i wsp. 1997: Biotechniąues, 22:88-90)

Zasada: W metodzie tej rozdziela się kwasy nukleinowe na frakcje o małej (RNA i fragmenty DNA) oraz dużej masie (DNA wysokocząsteczkowy). Frakcja zawierająca RNA, pomimo obecności DNA, może być stosowana w reakcji RT-PCR.

Materiał: Materiał biopsyjny.

Odczynniki:

1)    Bufor denaturujący o pH 8,0: 7 M mocznik - 2% SDS - 5 mM EDTA.

2)    Mieszanina: fenoi/chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1).

3)    Mieszanina: chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 24:1).

4)    Izopropanol.

5)    Bufor TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA.

6)    Bufor SET (sodium chloride - EDTA - Tris/HCl): 150 mM NaCl - 5 mM EDTA - 50 mM Tris/HCl (pH 8,0).

7)    10% roztwór SDS.

8)    Roztwór proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml.

9)    96% roztwór etanolu.

Ważniejszy przyrząd: Homogenizator tłokowy.

Wykonanie:

1.    Około 4 mm tkanki z biopsji cienkoigłowej (50-200 mg) zanurzyć w buforze denaturującym (odcz. 1) i rozdrobnić z użyciem skalpela.

2.    Przenieść rozdrobniony materiał do probówki homogenizatora, dodać 1 ml odczynnika 2 i homogenizować.

3.    Przenieść homogenizat do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować (14 000 xg w temp. 4°C przez 10 min). Przenieść fazę górną do nowej probówki i ekstrahować chloroformem (odcz. 3) przez 15 min, mieszając bagietką. Przenieść górną fazę do nowej probówki i dodać równą objętość izopropanolu (odcz. 3).

4.    Łagodnie mieszać zawartość probówki przez odwracanie, aż utworzy się widoczna gruda (pecyna) DNA o dużej masie cząsteczkowej, łatwa do odzyskania.

5.    Pozostałość roztworu inkubować w temp. — 20°C przez 1 godz. i odwirować (14000 x g w temp. 4°C przez 10 min); usunąć supernatant. Zawiesić osad zawierający RNA i DNA o małej masie cząsteczkowej w buforze TE (odcz. 5) i stosować dalej w procedurach wymagających użycia RNA, np. RT-PCR.

6.    Odzyskaną w etapie 4. grudę DNA przenieść do probówki zawierającej 1,5 ml buforu SET (odcz. 6) z RNazą A o stężeniu 50 pg/ml. Przerwać trawienie RNazą przez dodanie SDS (odcz. 7) do końcowego stężenia 0,5%. Dodać proteinazę K (odcz. 8) do końcowego stężenia 1 mg/ml i inkubować w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia grudy DNA.

7.    Ekstrahować DNA mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 2). Dodać 2,5 objętości schłodzonego etanolu (odcz. 9), pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 min i odwirować (12000x0 w temp. pokojowej przez 5 min).

8.    Rozpuszczać DNA w buforze TE (odcz. 5) przez przynajmniej 12 godz.

387