07

NaCl dla różnych enzymów. Jeżeli DNA ma być trawiony przez dwa lub więcej enzymów, reakcję można przeprowadzić jednocześnie dla wszystkich enzymów jedynie wówczas, gdy można znaleźć bufor, w którym wszystkie enzymy działają efektywnie. Jeżeli bufory wymagane przez enzymy są różne, to można postępować w taki sposób: dokonać trawienia DNA wpierw enzymem wymagającym buforu o mniejszej sile jonowej, następnie dodać odpowiednią ilość NaCl i kontynuować inkubację z drugim enzymem. Można także zastosować opisany w ćwiczeniu bufor KGB.

6)    Stężone preparaty enzymów restrykcyjnych należy rozcieńczać w odpowiednim buforze, nigdy w H₂0. ze względu na możliwość denaturacji.

7)    Enzymy restrykcyjne są stabilne, jeżeli są przechowywane w temp. -20°C w buforze zawierającym 50% glicerol. Przygotowując reakcję enzymatyczną należy osiągnąć etap, w którym dodaje się enzymu, i dopiero wówczas wyjąć enzym z zamrażarki i natychmiast umieścić w lodzie; pobierać enzym tak szybko, jak jest to możliwe i natychmiast po użyciu umieścić go na powrót w zamrażarce.

8)    Trzeba pamiętać, że większość enzymów restrykcyjnych jest droga. Do efektywnego ich wykorzystania mogą być pomocne następujące wskazówki:

a)    Wiele enzymów nabytych w handlu dostarczanych jest w formie stężonej, tak że często l ul preparatu wystarcza do strawienia 10 pg DNA w ciągu 1 godz. Ażeby pobrać małą ilość enzymu, można dotknąć pow ierzchni roztworu końcem końcówki pipety automatycznej do utworzenia się warstwy powierzchniowej z meniskiem. W ten sposób pobiera się ok. 0,1 pl preparatu enzymatycznego.

b)    Należy dążyć do utrzymania minimalnej objętości mieszaniny reakcyjnej przez maksymalne możliwe zmniejszenie ilości H₂0, jednakże objętość roztworu zawierającego enzym musi stanowić mniej niż 0,1 końcowej objętości reakcji, w przeciwnym wypadku enzym może być hamowany przez glicerol.

c)    Ilość enzymu konieczną do strawienia danej ilości DNA można zmniejszyć wydłużając czas inkubacji.

10.3.3. Elektroforetyczna analiza kwasów nukleinowych w żelu agarozowym i poliakrylamidowym

Klcktroforeza. czyli ruch naładowanych cząstek w' zewnętrznym polu elektrycznym, jest obecnie jedną z głównych technik służących do identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Ostatnie lata przyniosły znaczący rozw'ój technik dektroforetycznych, który spowodował znaczne rozszerzenie tej metody I poza wymienione zastosowania. W w^jersji podstawkowej elektroforeza w-‘ żelach j agarozowych i poliakrylamidowych jest szybką i prostą techniką odpowiednią do ' rozdziału cząsteczek DNA, które nie mogą być właściwie rozdzielone innymi j metodami, np. poprzez wirowanie w gradiencie gęstości. Kwasy nukleinowa w żelu zlokalizować można bezpośrednio przez ich znakowanie fluoroforami, z których najczęściej stosuje się bromek etydyny.

437