00

Ćwiczenie 10.37. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym (J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A łaboratory manuał. Book 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, 6.9-6.17)

Zasada: W metodzie wykorzystuje się zależność ruchliwości elektroforetycznej cząsteczek dwuniciowego DNA od jego masy cząsteczkowej w przybliżeniu ruchliwość jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z masy cząsteczkowej DNA. Żele agarozowc pozwalają na efektywny rozdział cząsteczek DNA o długości w przedziale 0,1-60 kpz. Podczas rozdziału cząsteczek DNA innych niż liniowe, ruchliwość elektroforetyczna zależy — na ogół silnie od konformacji. Obecność bromku etydyny w żelu zmniejsza ruchliwość liniowych cząsteczek DNA

0    ok. 15% i może zmieniać konformację DNA występującego w innej formie niż liniowa.

Materiał: Roztwór DNA.

Odczynniki:

1)    Bufor elektroforetyczny (lab. 10.7).

2)    Agaroza.

3)    Roztwór bromku etydyny o stężeniu 10 mg,'ml.

4)    Bufor obciążający (tab. 10.8)

Aparatura: Aparat do elektroforezy z wyposażeniem, lampa UV lub transiluminator, mikrowirówka.

Wykonanie:

1.    Okleić płytkę do elektroforezy taśmą i umieścić ją na wypoziomowanym stoliku. Przygotować odpowiednią ilość buforu elektroloretycznego (odcz. 1), aby wypełnić zbiornik do elektroforezy i sporządzić żel. Dodać odpowiednią ilość agarozy, zależnie od oczekiwanej długości rozdzielanego DNA (tab. 10.6), do naczynia Erlenmaycra zawierającego odpowiednią ilość buforu do sporządzenia żelu. Zaznaczyć poziom cieczy i zamknąć luźno wlot naczynia np. kawałkiem bibuły.

2.    Ogrzewać zawiesinę agarozy aż do jej zupełnego rozpuszczenia. W razie ubytku cieczy uzupełnić jej objętość wodą.

3.    Ochłodzić roztwór agarozy do temp. 60' C i, jeżeli jest to wymagane, dodać bromek etydyny (odcz. 3) do końcowego stężenia 0,5 pg/ml.

4.    Używając pipety automatycznej wprowadzić niewielką ilość agarozy w miejscu przylegania taśmy do płytki do elektroforezy w celu jej uszczelnienia. Odczekać chwilę do zestalenia agarozy. Umieścić grzebień w płytce tak, aby jego zęby znajdowały się 0,5-1 mm nad powierzchnią płytki. Wylać pozostałość agarozy na płytkę; żel powinien mieć grubość 3-5 mm. Po spolimeryzowaniu żelu (w temp. pokojowej przez 30-45 min) usunąć żel i taśmę i umieścić płytkę w aparacie do elektroforezy.

5.    Dodać taką ilość buforu do elektroforezy, aby jego poziom przekraczał o ok.

1    mm poziom żelu. Zmieszać, przez krótkie wirowanie próbki, DNA z buforem obciążającym (odcz. 4). Wprowadzić próbki do studzienek w żelu, używając strzykawki lub pipety.

6.    Podłączyć elektrody do źródła prądu tak, aby DNA migrował przez większą część żelu w kierunku anody i ustalić napięcie tak, aby natężenie pola elektrycznego

440