08

Elektroforeza w żelu agarozowym. Żeli agarozowych można używać do rozdziela DNA w stosunkowo szerokim zakresie mas cząsteczkowych (Sambrook i wsp. 1989\ (tab. 10.6). Zastosowanie agarozy o niskiej temperaturze topnienia zwiększa zakręt rozdziału.

Tabela 10.6. Zakres rozdziału żeli agarozowych o różnych stężeniach

Stężenie agarozy (%)	Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (kpz)
0,3	5-60
0,6	1-20
0.7	0,8-10
0.9	0,5-7
1.2	0.4 6
1,5	0,2-3
2.0	0,1-2

Elektroforezę w żelach agarozowych przeprowadza się zazwyczaj w aparatach ustawionych poziemo^ Cząsteczki^DNA otych samych masach, lecz róznycB" konformacjach, charakteryzują się różną ruchliwością elektroforetyczną; w pewnych warunkach forma I (OC) migruje z większą szybkością niż forma III (CCCI, w innych warunkach relacja ta może ulec odwróceniu. Ruchliwość elektroforetyczną liniowego dwuniciowego DNA jest w przybliżeniu odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z liczby par zasad. Pod niskim napięciem szybkość poruszania się liniowego DNA jest proporcjonalna^ przyłożonego napięcia, jednakże gdy natężenie pola elektrycznego wzrasta, cząsteczki DNA o dużej masie cząsteczkowej wędrują w zróżnicowany sposób. Aby otrzymać optymalny rozdział fragmentów większych od 2 kpz, elektroforezę należy przeprowadzać przy natężeniu pola elektrycznego nie większym ni/ 5 V/cm. Ruch DNA w żelu agarozowym nie zależy ladskladu zasad i słabo zależy od temperatury, co umożliwia przeprowadzanie elektroforezy w temperaturze pokojowej. Jednakże używając żeli o stężeniach agarozy mniejszych niż 0,5% oraz stosując agarozę o niskiej temperaturze topnienia, trzeba przeprowadzać rozdział w temperaturze ok. 4°C.

Ruchliwość elektroforetyczną DNA zależy od składu i siły jonowęj buforu, w którym przeprowadza się elektroforezę. W przypadku zupełnego braku jonów przewodnictwo roztworu jest bardzo niskie i DNA porusza się z bardzo małą szybkością lub wcale. W roztworze o bardzo dużej sile'jonowej podczas elektroforezy wydziela się wiele ciepła i DNA może ulec denaturacji termicznej. Najczęściej w elektroforezie stosuje się bufory TAE (Tris-acetate-EDTA), TPE (Tris-pho-sphate-EDTA) i TBE (Tris-boran-EDTA)7 a w wersji zasadowej bufor zasadowych. 10.7).

Wprowadzając próbki DNA do roztworu należy stosować bufory obciążające, 'zwiększające gęstość próbek, przez co wędrują one bezpośrednio do studzienek żelu. Odpowiednio zabarwiony bufor obciążający pozwala śledzić proces wprowadzania próbek do studzienek oraz określać ich położenie podczas elektroforezy. Należy

⁴³⁸ AJ iW,

T