03

Odzyskiwanie DNA po elektroforezie w żelu agarozowym. Jeśli stosuje się elektroforezę w żelu agarozowym jako metodę preparatywną, zachodzi konieczność odzyskania i oczyszczenia DNA po elektroforezie. Postępowanie to napotyka jednak na trudności, wśród których najważniejsze to: 1) Obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych agaroza bez gwarantowanego stopnia czystości może zawierać inhibitory, które zostaną włączone do preparatu odzyskiwanego DNA. 2) Mała efektywność odzyskiwania z żelu agarozowego długich fragmentów DNA, ponieważ jest ona funkcją ich masy cząsteczkowej. Większość metod daje zadowalającą wydajność odzysku(>50%) tylko dla fragmentów DNA, których długość nie przekracza 5 kpz. 3) Słaba skuteczność odzyskiwania małych ilości DNA. Jeśli ilość DNA jest mniejsza od 500 ng, to niektóre techniki przynoszą taką stratę DNA, że proces odzyskiwania nic warto przeprowadzać. 4) Trudności w jednoczesnym operowaniu wieloma próbkami — większość metod odzysku jest pracochłonna i wymaga przeprowadzenia kilku procesów, zatem możliwość jednoczesnego opracowywania kilku próbek jest ograniczona.

Ćwiczenie 10.39. Odzyskiwanie DNA z żelu agarozowego przez elektroforezę na

DEAE celulozę (G. Dretzen i wsp. 1981: Anal. Biochem., 113:259 -266)

Zasada: W metodzie tej DNA jest analizowany clektroforetycznie w żelu agarozowym. Po rozdziale — bezpośrednio przed pasmem DNA, który ma być odzyskany — żel nacina się tak, że powstaje w nim szczelina, w którą wsuwa się fragment membrany DEAE-celulozy. Następnie prowadzi się dalej elektroforezę, aż całość DNA znajdzie się na fragmencie celulozy, który wówczas usuwa się z żelu i płucze w buforze o niskiej sile jonowej. DNA jest eluowany z fragmentu do roztworu o wysokiej sile jonowej.

Materiał: Roztwór DNA.

Odczynniki:

IJ 10 mM roztwór KDTA (pH 8,0).

2)    0,5 M roztwór NaOH.

3)    Bufor do płukania o pH 8,0: 50 mM Tris/HCl - 0,15 M NaCl - 10 mM EDTA.

4)    Bufor do clucji o pH 8,0: 50 mM Tris/HCl - 1 M NaCl - 10 mM ED TA.

5)    Mieszanina: fcnol/chloroform,'alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1).

6)    10 mM roztwór CH jCOONH₄.

7)    96% roztwór etanolu.

8)    70% roztwór etanolu.

9)    Bufor TE o pH 7.6: 10 mM Tris/HCl - I mM EDTA.

Aparatura: Aparat do elektroforezy, lampa UV, łaźnia wodna o zakresie temperatur obejmującym 65X, mikro wirówka.

Wykonanie:

1.    Przeprowadzić elektroforezę badanego DNA z bromkiem etydyny i zlokalizować pasma DNA w świetle lampy UV.

2.    Używając skalpela zrobić nacięcie w żelu na wprost przedniej (tj. od strony anody) granicy interesującego nas pasma; nacięcie to powinno być dłuższe o ok. 5 mm od szerokości pasma. Wyciąć kawałek DEAE-celulozy o szerokości równej szerokości nacięcia i wysokości nieznacznie (ok. 1 mm) większej od grubości żelu.

443