00

Ćwiczenie 10.17. Odróżnienie RNA od DNA

a)    Reakcja orcynolowa. Do 2 probówek zawierających po l ml 0,1% roztworów RNA lub DNA dodać równą objętość odczynnika orcynolowego (ćw. 9.11) i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 15 min. W probówce zawierającej RNA powstaje zielone zabarwienie. DNA daje około 10-krotnie słabszy odczyn z odczynnikiem orcynolowym.

Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach, ogrzewane ze stężonym roztworem HC1 przechodzą w furfural, który z orcyną i jonami Fe^{3 +} tworzy trwały kompleks o zielonej barwie.

b)    Reakcja na pentozę. Do 1 ml 0,1% roztworu RNA dodać 1 ml stężonego roztworu HC1 i kryształek floroglucyny. Roztwór ogrzać do wrzenia. Powstaje czerwone zabarwienie, świadczące o obecności pentozy.

c)    Reakcja difenyloaminowa. Do 2 probówek zawierających po 1 ml 0,1% roztworów RNA lub DNA dodać podwójną objętość odczynnika difenyloaminowego (ćw. 9.12). Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 min. W probówce zawierającej DNA powstaje niebieskie zabarwienie. Barwny kompleks z difenylo-aminą daje deoksyryboza. RNA nie wykazuje dodatniego odczynu.

d)    Reakcja Feulgena na deoksyrybozę. Do 1 ml 0,1% roztworu DNA dodać 5-6 kropli 1 M roztworu HC1 i probówkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 min. Po oziębieniu doprowadzić pH roztworu do 5 za pomocą 0,1 M roztworu NaOH. Następnie dodać 2 ml odczynnika Schiffa na aldehydy. Powstaje czerwone zabarwienie wskazujące na obecność deoksyrybozy. Powtórzyć powyższą próbę z roztworem RNA.

Odczynnik Schiffa: 0,2 g fuksyny rozpuścić na gorąco w 120 ml H₂0. Po ostudzeniu dodać stopniowo 10% roztwór NaHSOj aż do odbarwienia roztworu. Reakcja Feulgena z odczynnikiem Schiffa jest szeroko stosowana w metodach histochemicz-nych do wybiórczego wybarwiania jąder i chromosomów. Deoksyryboza uwolniona w kwasowym środowisku z DNA (hydroliza wiązania /?-glikozydowego i uwolnienie grupy aldehydowej) daje dodatni odczyn z odczynnikiem Schiffa.

Ćwiczenie 10.18. Tworzenie kompleksów z barwnikami

Zasada: W kwasowym środowisku RNA i DNA wiążą zasadowe barwniki. Tę właściwość wykorzystuje się w badaniach komórek i tkanek metodami histochemi-cznymi. Najpopularniejszą metodą pozostaje wybarwianie jąder komórkowych zasadową hematoksyliną. Oddziaływanie różnych barwników, także fluorescencyjnych, z DNA znalazło zastosowanie w technice prążkowego barwienia chromosomów metafazowych (ostatnio też prometafazowych i profazowych). Takie barwienie umożliwia wykrycie 400-1250 prążków, ułożonych poprzecznie w stosunku do długiej osi chromatyd i różniących się szerokością oraz intensywnością wybar-wienia. Wzór prążkowy powstaje w wyniku kondensacji kwasów nukleinowych pod wpływem określonych barwników. Na zjawisko to istotny wpływ mają także różne białka, swoiście współtworzące wyższego rzędu struktury włókien nukleoproteino-wych. Ciemne prążki są widoczne po wybarwieniu odczynnikiem Giemsy (prążki G)

390