3110399257

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 14

Dzień 2

4.    Do każdej z wysterylizowanych butelek z pożywką, w jałowy sposób dodać ampicylinę (lub alternatywny antybiotyk) tak, aby stężenie końcowe antybiotyku osiągnęło wartość 100 pg/mL podłoża.

5.    Przenieść pojedynczą kolonię ze świeżej selektywnej hodowli płytkowej do butelek z 25 mL podłoża bulionowego w celu uzyskania inoculum (starterów). Inkubować startery, energicznie mieszając, w cieplarce o temperaturze 37 °C przez około 8 godzin.

6.    Dodać po 5 mL hodowli startowej do wszystkich trzech butelek zawierających po 300 mL sterylnego, wcześniej przygotowanego podłoża. Hodowlę bakterii należy prowadzić, energicznie mieszając, w temperaturze 37 °C do osiągnięcia fazy logarytmicznego wzrostu, tj. przez około 16 - 18 godzin. Gęstość komórek w hodowli E. coli prowadzonej w tych warunkach (ciemność, wstrząsanie, temperatura 37°C) powinna wynosić około 3 - 4 x 10⁹ komórek/mL, co odpowiada stężeniu bakterii około 3 g/L.

Dzień 3

7.    Odwirować zawiesinę komórek E. coli przy 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant odrzucić, osad komórek przechowywać w temperaturze -20 °C lub zawiesić w odpowiedniej (wyjściowej dla hodowli) objętości buforu TE (pH 8,0).

3.2.2 Izolowanie ultraczystego plazmidowego DNA z komórek bakterii

1.1    Zawiesinę komórek E. coli w buforze TE (1,5 - 3,0 mL) odwirować, jak podano powyżej.

1.2    Otrzymany osad zawiesić (przez pipetowanie lub worteksowanie) w 200pl roztworu do zawieszania LI. Niedokładne zawieszenie osadu zmniejszy wydajność preparatyki.

1.3    Dodać 200pl roztworu lizującego L2 i po dokładnym, delikatnym wymieszaniu przez odwracanie probówki zawartość pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej. (Uwaga! Nie worteksować probówki! Worteksowanie spowoduje fragmentację genomowego DNA.) Powinna powstać jednolita, prawie przezroczysta galaretowata masa. Roztwór L2 zawiera detergent (SDS) w roztworze NaOH. SDS powoduje upłynnienie zawartych w błonach komórkowych fosfolipidów i białek. Odczyn zasadowy powoduje denaturację białek plazmidowego i chromosomalnego DNA oraz powoduje hydrolizę RNA (zhydrolizowane RNA nie wykazuje powinowactwa do złoża minikolumny). Jeżeli roztwór L2 nie jest klarowny (precypitacja SDS), należy go ogrzewać w temperaturze około 40°C do uzyskania klarowności.

Uwaga: Po dodaniu roztworu L2 należy bardzo ostrożnie mieszać zawartość probówki, aby nie spowodować fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarcza 5 - 6-cio krotne odwrócenie probówki. Po 3 minutach inkubacji lizat powinien być całkowicie klarowny. Jeżeli roztwór nie jest w pełni klarowny, należy powtórzyć delikatne mieszanie i kontynuować inkubację.

1.4    Dodać 400 pL roztworu zobojętniającego GL3 i dokładnie, delikatnie wymieszać przez kilkukrotne (6 - 10 krotne) odwracanie probówki. Mieszanina powinna mieć postać białych lepkich kłaczków zawieszonych w klarownym płynie. Można próbkę pozostawić na 10 - 15 minut w lodzie. Roztwór GL3 zawiera stężony octan potasu pH 5,0. Dodanie buforu GL3 powoduje precypitację chromosomalnego DNA, zdenaturowanych białek oraz większości detergentu. Plazmidowy DNA (mały, superhelikalny) po zobojętnieniu roztworu łatwo renaturuje i przechodzi do roztworu.

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia