3110399256

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 13

granicy faz fenol-woda. Faza wodna zawiera plazmidowe DNA i RNA. Kwasów rybonukleinowych pozbywamy się dodając rybonukleazę A (RN-azę).

W drugim etapie izolowania, plazmidowy DNA zostaje związany ze specjalnie spreparowanym złożem krzemionkowym minikolumny. DNA przechodząc przez złoże jest na nim adsorbowany, podczas gdy zanieczyszczenia (np. inne struktury komórkowe) nie są przez nie wiązane. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, plazmidowy DNA wymywany jest z minikolumny określonym buforem (lub wodą). Otrzymany tą metodą ultraczysty, plazmidowy DNA jest szeroko wykorzystywany w biologii molekularnej.

Odczynniki

1.    podłoże TSA (ang. Tryptone Soya Agar) 40 g/L (trypton 15 g, pepton sojowy 5 g, agar 15 g, NaCI 5 g);

2.    podłoże LB (trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, NaCI 10 g/L); lub TSB 30 g/L (kazeina trawiona sokiem trzustkowym 17 g, mączka sojowa trawiona papainą 3 g, NaCI 5 g, dwuzasadowy fosforan potasu 2,5 g, glukoza 2,5 g);

3.    ampicylina (sól sodowa): roztwór wyjściowy o stężeniu 50 mg/mL w H₂0 (przechowywać w temperaturze -20 °C); roztwór roboczy o stężeniu 100 pg/mL (rozcieńczenie roztworu wyjściowego 1:500);

4.    roztwór do zawieszania komórek LI (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 100 pg/mL RNA-za A; pH 8,0);

5.    roztwór lizujący L2 (1 % SDS / 0,2 M NaOH);

6.    roztwór zobojętniający GL3 (3 M octan potasu; pH 5,0);

7.    roztwór płuczący W (4,2 M chlorowodorek guanidyny);

8.    roztwór płuczący Al (15 % etanol);

9.    roztwór TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA; pH 8,0; sterylizowany przez 20 minut w 70 °C);

10.    kolumna ze złożem do oczyszczania DNA plazmidowego;

11.    bufor TBA (5x: 54 g Tris, 27,5 g kwas borowy, 20 ml 0,5 M EDTA o pH 8,0 uzupełnić do objętości 1 litra wodą dejonizowaną).

Uwaga: Przez cały czas wykonywania ćwiczenia należy pracować w rękawiczkach ochronnych celem zabezpieczenia materiału przed obcym DNA/RNA.

3.2.1 Przygotowanie zawiesiny komórek E. coli

Dzień 1

1.    Wylać podłoże LB (Miller) agar lub Tryptone Soya Agar, po dodaniu ampicyliny, na płytki Petriego i poczekać do jego zestalenia się.

2.    Po sterylizacji ezy płomieniem palnika przenieść redukcyjnie bakterie E. coli na płytkę. Zostawić odwrócone płytki w cieplarce o temperaturze 37 °C na całą noc.

3. Przygotować płynne podłoże LB lub Tryptone Soya Broth w stężeniu 25 g bulionu w 1 litrze destylowanej wody. Rozlać po 25 ml przygotowanego bulionu do dwóch 50 ml butelek (kultury startowe) oraz po 300 ml do trzech butelek o pojemności 1 litra (hodowle właściwe); wszystkie zamknięte butelki poddać sterylizacji w autoklawie, w temperaturze 121 °C, przez 15 minut.

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia