3110399269

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych.

Podczas nanoszenia próbek na żel stosuje się bufory obciążające, które zwiększają gęstość próbek, co pomaga wprowadzić je bezpośrednio do studzienek żelu. Barwniki buforu obciążającego pozwalają także śledzić położenie migrujących w żelu prób podczas elektroforezy. Wizualizację cząsteczek DNA uzyskuje się bądź przez płukanie żelu po rozdziale w roztworze bromku etydyny (EtBr) bądź przez dodanie go bezpośrednio do próbek lub wylewanego żelu; barwnik widoczny jest dopiero po ekspozycji w spolaryzowanym świetle ultrafioletowym (X. = 300nm).

Elektroforeza agarozowa fragmentów DNA jest również stosowana w skali preparatywnej. Fragmenty są z żelu wycinane i poddawane oczyszczeniu z agarozy i bromku etydyny a następnie wykorzystywane do wielu eksperymentów (np. ligacji z nowym wektorem).

W zależności od wymagań dotyczących analizowanego materiału stosuje się różne warianty elektroforezy w żelach agarozowych:

•    natywna elektroforeza DNA w żelu agarozowym - w tej metodzie wykorzystuje się zależność ruchliwości elektroforetycznej cząsteczek dwuniciowego DNA od jego masy cząsteczkowej;

•    elektroforeza DNA w żelu agarozowym w warunkach denaturujących - wariant ten stosuje się do analizy jednoniciowego DNA; czynnikiem rozszczepiającym nici kwasu nukleinowego jest wodorotlenek sodowy, którego roztwór dodaje się do stopionego roztworu agarozy; w celu przeciwdziałania parowaniu się komplementarnych zasad podczas rozdziału stosuje się bufor alkaliczny.

2.3 Czynniki wpływające na tempo migracji DNA w żelu agarozowym

•    masa cząsteczkowa DNA - większe cząsteczki DNA migrują wolniej (ze względu na większy opór oraz trudności w penetrowaniu porów żelu) niż mniejsze cząsteczki; tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesiętnego z masy cząsteczkowej DNA;

•    konformacja DNA - w przypadku mieszaniny fragmentów DNA o różnych konformacjach, ale identycznych masach cząsteczkowych, migrować one będą w następującej kolejności: postać jednoniciowa, następnie dwuniciowa i, wykazująca najmniejszą ruchliwość elektroforetyczną, forma kolista (np. plazmid);

•    stężenie agarozy - zwiększenie stężenia agarozy powoduje zwolnienie tempa migracji DNA w żelu; optymalne stężenia agarozy do rozdziału fragmentów DNA o określonej wielkości ustalone zostały empirycznie (tabela 10.5);

Tabela 10.5. Umowne stężenia żeli agarozowych w zależności od wielkości rozdzielanych fragmentów DNA.

wielkość rozdzielanego DNA [kb]	stężenie agarozy [%]
5-60	0,3
1-20	0,6
0,8-10	0,7
0,5-7	0,9
0,4-6	1,2
0,2-3	1,5
0,1-2	2,0

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia