3110399263

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych.

zastosowanie podczas etapu odlipidowania mieszanin aceton:chloroform = 5:1 w temperaturze 0 °C a następnie etanoketer = 3:1 w temperaturze 37 °C pozwala na uzyskanie odwodnionego homogenatu.

Pierwsze trzy etapy frakcjonowania składników materiału genetycznego metodą Schneidera (tabela 10.2) są tożsame z metodyką zaproponowaną przez Schmidta i Thannhausera. Postępowaniem rozróżniającym omawiane techniki izolacji jest zastosowanie innego czynnika hydrolizującego homogenat tkankowy po wydzieleniu z niego frakcji związków fosforowych rozpuszczalnych w kwasach organicznych oraz frakcji fosfolipidowej. Metoda Schneidera zakłada rozdział frakcji kwasów nukleinowych i frakcji proteinowej poprzez kwasową hydrolizę homogenatu komórkowego roztworami kwasów trichlorooctowego lub nadchlorowego w temperaturze 90 °C. Niestety dalsze rozdzielenie otrzymanej mieszaniny zawierającej deoksyrybo- i rybonukleotydy, pentozy (deoksyrybozy i rybozy) oraz wolne zasady azotowe nie jest możliwe prostymi metodami. Ilościowe oznaczenie DNA w uzyskanej mieszaninie przeprowadza się na drodze specyficznej reakcji Dischego pozwalającej wykryć deoksyrybozę.

Tabela 10.2. Wydzielanie kwasów nukleinowych metodą Schneidera [1].

frakcja	postępowanie	związki fosforowe występujące w otrzymanej frakcji
materiał wyjściowy (tkanka)	homogenizacja tkanki świeżej lub zamrożonej
FI	3-krotna ekstrakcja homogenatu tkankowego schłodzonym (4 °C) 5 -10 % CCI₃COOH	rozpuszczalne w kwasach związki fosforowe
F2	ekstrakcja homogenatu 80 % etanolem (25 °C) lub mieszaniną etanokchloroform = 3:1 (50 - 60 °C) lub mieszaniną etanoketer = 1:1 (25 °C)	fosfolipidy
F3	kwasowa hydroliza homogenatu 5%CCI₃COOH lub 6 % HCI0₄ w 90 °C przez 15 min.	deoksy ry bo n u kleoty dy, rybonukleotydy, część fosfoprotein

Liczne doniesienia literaturowe dotyczące wydzielania frakcji kwasów nukleinowych metodami Schmidta i Thannhausera oraz Schneidera z różnych tkanek zwierzęcych, np. grasicy, śledziony, trzustki, wskazują na dużą zgodność ilościowych oznaczeń DNA i RNA. Znaczne różnice cechuje natomiast analiza ilościowa frakcji DNA i RNA wydzielonych wspomnianymi metodami z tkanek mózgowej i nerwowej oraz wątroby. Wynika to prawdopodobnie ze znacznej ilości nierozpuszczalnych w kwasach organicznych i niezwiązanych z kwasami nukleinowymi fosfoprotein oraz kompleksów białek z inozynofosforanami. W takich przypadkach metodykę frakcjonowania kwasów nukleinowych rozszerza się o metodę Delory (1938 r.) wytrącania fosforanów nieorganicznych w postaci osadu Ca₃(P0₄)₂ na agregatach nierozpuszczalnych w wodzie cząsteczek MgC0₃.

W odniesieniu do tkanek pochodzenia roślinnego jednymi z częściej stosowanych są warianty metody Ogura i Rosena (tabela 10.3), która pierwotnie (1950 r.) została opracowana na potrzeby oznaczania DNA i RNA (ilości rzędu 1 pg) w merystemach wierzchołkowych korzeni oraz w pylnikach. Metod Schmidta i Thannhausera oraz Schneidera nie da się zastosować podczas frakcjonowania materiału roślinnego z uwagi na występowanie w nim specyficznych dla tkanek roślinnych związków przeszkadzających w izolacji, np.: pentozanów czy poliuronidów. W pierwszym etapie etanolem oraz mieszaniną etanolu i eteru oddziela się związki rozpuszczalne w tych odczynnikach. Realizowana w temperaturze 4 °C długotrwała ekstrakcja homogenatu schłodzonym 1 M kwasem nadchlorowym

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia