3110399258

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 15

1.5    Probówkę wraz z zawartością wirować przez 10 - 15 minut przy prędkości wirowania 10 - 15 tys. rpm. Uzyskany supernatant zawiera plazmidowy DNA, częściowo zhydrolizowany RNA oraz część białek.

1.6    Ostrożnie przenieść, przez zlanie, supernatant do minikolumny w celu oczyszczenia plazmidowego DNA. Poczekać aż cały supernatant wejdzie w złoże.

1.7    Nanieść na minikolumnę, umieszczoną w probówce wirówkowej 500pl pierwszego roztworu płuczącego W. Roztwór ten zawiera sól chaotropową - 4,2M chlorowodorek guanidyny. Następuje związanie się do złoża plazmidowego DNA.

1.8    Wirować probówkę z kolumną przez 1 minutę przy 10 - 15 tys. rpm.

1.9    Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać przesącz (niezwiązane z kolumną zanieczyszczenia) i ponownie włożyć kolumnę do nowej probówki.

1.10    Do kolumny dodać 700pl drugiego roztworu płuczącego Al. Etanol ma za zadanie wypłukać z kolumny sól chaotropową, która mogłaby przeszkadzać np. w trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

1.11    Wirować 2 minuty przy 10 - 15 tys. rpm.

1.12    Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce o pojemności l,5ml i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 60pl jałowego roztworu TE. Próbkę inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Plazmidowe DNA znajdujące się na złożu jest rozpuszczane w roztworze Tris-EDTA, służącym do przechowywania DNA. Bufor zapewnia stabilność pH roztworu, a EDTA w małym stężeniu chelatuje jony Mg²*, chroniąc DNA przed nukleazami wymagającymi tych jonów jako kofaktora.

1.13    Wirować 1 minutę przy 10 - 15 tys. rpm.

1.14    Usunąć kolumnę, a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce umieścić w łaźni lodowej (0°C). Niewykorzystaną część preparatu przechowywać w temperaturze -20°C.

3.2.3 Trawienie plazmidu enzymem restrykcyjnym

Odczynniki

1.    plazmid pUC19 (patrz pkt. 2.14);

2.    enzymy restrykcyjne: EcoRI, Haell;

3.    10 X stężony bufor dla EcoRI (lOOmM Tris-HCI, pH 7,5 w 25 °C; 50 mM NaCI; 10 mM chlorek magnezu; 0,025 %Triton X-100);

4.    10 X stężony bufor dla Haell (lOmM Tris-HCI, pH 7,9 w 25 °C; 50 mM NaCI; 10 mM chlorek magnezu; 1 mM ditiotreitol;

5.    standard wielkości DNA (mieszanina fragmentów DNA o określonych masach cząsteczkowych).

Wykonanie

3.1    Przenieść 15 - 20pl wyizolowanego plazmidu pUC19 do 2 nowych probówek Eppendorf oznaczonych „E" i „H" (jedną końcówką).

1.2    Do probówki oznaczonej „E" dodać 2,5pl wody destylowanej i 2pl 10x stężonego buforu dla EcoRI. Do probówki oznaczonej „H" dodać 2,5pl wody destylowanej oraz 2pl 10x stężonego buforu dla Haell. Uwaga: wodę i bufory dodawać różnymi końcówkami.

1.3    Mieszaniny reakcyjne delikatnie mieszać poprzez uderzenia palcem.

1.4    Po przygotowaniu mieszanin reakcyjnych wyjąć enzymy restrykcyjne z temperatury -20°C do naczynia z lodem i dodać: 1 |xl (1 - 2 jednostki) EcoRI do probówki „E" i lpl (1-2 jednostki) Haell

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia