3110399253

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 10

•    gradient potencjału elektrycznego - dla niskich wartości tempo migracji liniowych cząsteczek DNA jest wprost proporcjonalne do niego - zależność ta przestaje obowiązywać w przypadku stosowania wysokich napięć; w czasie rozdziału cząsteczek większych niż 2kb nie należy stosować napięcia większego niż 5 V/mL żelu;

•    temperatura w zakresie od 4 °C do 30 °C nie wpływa w istotnym stopniu na elektroforetyczne własności DNA; podczas elektroforezy w żelach z niskim stężeniem agarozy należy zwrócić uwagę na parametry dotyczące prądu elektrycznego, ciepło wydzielane podczas rozdziału może powodować topienie się żelu;

•    bromek etydyny (EtBr) - obecność tego interkalującego barwnika spowalnia tempo migracji DNA o około 15 %.

•    skład i siła jonowa buforu - w buforze o niskiej sile jonowej kwas nukleinowy migruje bardzo wolno, w buforze o wysokiej sile jonowej wydzielana jest duża ilość ciepła, które może spowodować rozpuszczenie agarozy oraz denaturację DNA; najpowszechniej stosowane są dwa bufory: TAE (Tris-Acetic-EDTA) oraz TBE (Tris-Boric-EDTA); do elektroforezy poliakrylamidowej stosuje się bufor o większej pojemności buforowej tj. TBE. Skład najczęściej wykorzystywanych buforów przedstawiony został w tabeli 10.6.

Tabela 10.6. Skład buforów stosowanych w elektroforezie w żelach agarozowych.

symbol i nazwa buforu

TAE (Tris-Acetate-EDTA) TBE (Tris- Borate-EDTA) TPE (Tris-Phosphorate-EDTA) alkaliczny

stężenie robocze składników (lx)

0,04 M Tris-octan, 0,001 M EDTA 0,045 M Tris-boran, 0,001 M EDTA 0,09 M Tris-fosforan, 0,002 M EDTA 50 mM NaOH, 1 mM EDTA

3. Wykonanie ćwiczenia

3.1 Preparatyka DNA z grasicy cielęcej metodą Marmura

Grasica jest niezbędnym dla rozwoju odporności organizmu centralnym gruczołem endokrynnym układu lifatycznego, który kontroluje rozwój obwodowych tkanek limfatycznych (tzn. węzłów chłonnych, śledziony) podczas rozwoju zarodkowego i w okresie dojrzewania organizmu. Gruczoł ten zlokalizowany jest w śródpiersiu, bezpośrednio za mostkiem. W przypadku człowieka rozrost grasicy (do ok. 25 g) obserwuje się do ok. 2 roku życia i w takiej postaci pozostaje do okresu dojrzewania po czym ulega wyraźnemu zmniejszeniu (do ok. 0,5 g w wieku ok. 60 lat). Limfocyty, z których zbudowana jest grasica (zwane tymocytami) migrują do obwodowych tkanek limfatycznych zasiedlając je. Hormonami wydzielanymi przez grasicę są: tymozyna, grasiczy czynnik humoralny (THF), tymulina, tymopoetyna. Stymulują one powstawanie, różnicowanie i dojrzewanie odpowiedzialnych za odporność organizmu limfocytów T a także pośrednio wpływają na reakcje związane z odrzuceniem przeszczepu oraz mechanizmy obronne skierowane przeciwko komórkom nowotworowym.

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia