3110399265

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych.

2. Elektroforeza, jako podstawowa technika rozdziału makromolekuł w naukach biologicznych.

We wszystkich dziedzinach biologii eksperymentalnej (szczególnie nauk biochemicznych), w celu rozdziału mieszanin kwasów nukleinowych a także białek i polipeptydów, najczęściej stosowane są techniki elektroforetyczne. Jako zjawisko fizyko-chemiczne, elektroforeza jest ruchem posiadającej ładunek fazy rozproszonej względem pewnej fazy ciągłej w polu elektrycznym. Fazę rozproszoną stanowią cząsteczki koloidów i inne makrocząsteczki, a fazę ciągłą odpowiednio dobrany bufor (elektroforeza swobodna) lub nośnik go zawierający (elektroforeza żelowa, elektroforeza bibułowa). Stosowana we wszystkich technikach elektroforetycznych zasada rozdziału cząstek mieszanin polega na wykorzystaniu zjawiska ich różnej ruchliwości w roztworach pod wpływem sztucznie wytworzonej i przyłożonej różnicy potencjałów elektrycznych.

Najczęściej stosowanym w biochemii rodzajem elektroforezy jest jej wariant żelowy. W elektroforezie żelowej nośnikiem zapewniającym odpowiednie warunki do rozdziału mieszaniny są odpowiednio dobrane porowate żele. Zastosowanie żeli zwiększa rozdzielczość metody rozdziału ze względu na dodatkowe występowanie w nich efektu przesiewania molekularnego (ang. molecular sieving effect). Rolę sita molekularnego spełniają kapilary i wolne przestrzenie występujące pomiędzy cząsteczkami monomerów żelu wypełnione odpowiednio dobranym buforem. Żele aktywnie uczestniczą w procesie rozdziału wchodząc, w uzależnione od rozmiaru rozdzielanych cząsteczek, interakcje z migrującymi cząstkami. Rezultatem tego jest rozdzielanie cząstek według ładunku oraz wielkości. Efekt przesiewania molekularnego nie odgrywa takiej samej roli we wszystkich rodzajach żeli. Dominuje on w żelach skrobiowych i poliakrylamidowych, podczas gdy w żelach agarozowych jest znacznie mniejszy. Gęstość powstałej podczas polimeryzacji trójwymiarowej siatki żelu może być różna w zależności od stężenia wyjściowych substratów użytych do jego wytworzenia oraz warunków formowania się (polimeryzacji) żelu.

2.1 Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (PAGE, ang. polyacrylamide gel electrophoresis)

Ze względu na dużą rozdzielczość i łatwość standaryzacji warunków analizy, elektroforeza w żelach poliakrylamidowych jest najpopularniejszą metodą rozdziału i oczyszczania polipeptydów oraz białek. Czynnikiem warunkującym rozdział mieszaniny białek w polu elektrycznym podczas elektroforezy są różnice w wartościach ładunków elektrycznych poszczególnych cząsteczek białek (elektroforeza natywna). Stosowany jako środowisko rozdziału poliakrylamid, warunkuje różną ruchliwość elektroforetyczną rozdzielanych polipeptydów w zależności od wielkości cząsteczki a więc pośrednio od ich masy cząsteczkowej. Żel poliakrylamidowy o określonym stosunku akrylamid : N,N'-metyleno-b/s-akrylamid [ CH₂=CH-CO-NH₂ : (CH₂(NH-CO-CH=CH₂)₂ ] tworzy sito (rysunek 10.1) rozdzielające cząsteczki o różnych rozmiarach, dla którego ruchliwość elektroforetyczną zależy zarówno od ładunku jak i od masy cząsteczkowej (dla białek globularnych) frakcjonowanych składników rozdzielanej mieszaniny.

Wzajemny stosunek stężenia składników użytych do otrzymania żelu decyduje o jego gęstości, lepkości i elastyczności. Ze względu na kruchość spolimeryzowanego żelu, w technikach elektroforetycznych stosuje się te, w których stężenie akrylamidu mieści się w granicach od 3 do ponad 30%. Stężone żele zawierają w swej strukturze pory o małych rozmiarach, przez które muszą przeciskać się migrujące cząstki natomiast w tych o niższych stężeniach pory są znacznie większe i łatwiejsze do penetracji.

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia