3110399260

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 17

rozpuszczenia wszystkich półprzezroczystych (opalizujących) cząstek agarozy i uzyskania jednorodnej mieszaniny. Po rozpuszczeniu się agarozy doprowadzić roztwór do wrzenia. W przypadku odparowania wody z kolby, należy uzupełnić straty przed ostudzeniem.

1.7    Schłodzić zawartość kolby do temperatury poniżej 60°C przed przystąpieniem do procesu wylewania żelu (tzw. „test policzkowy").

Uwaga: Gorąca agaroza (tj. o temperaturze powyżej 60°C) może spowodować zniszczenie zestawu wykonanego z tworzywa sztucznego.

1.8    Po schłodzeniu roztworu agarozy do temperatury poniżej 60°C, dodać EtBr do uzyskania stężenia 0,5 pg/mLżelu.

Uwaga: Bromek etydyny jest silnym mutagenem, zatem należy obchodzić się z nim ze szczególną ostrożnością. Podczas pracy wymagane jest bezwzględne noszenie gumowych rękawiczek i fartuchów. Zużyty roztwór bromku etydyny należy zlać do specjalnie oznaczonego naczynia.

1.9    Wlać ciepły roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej (z tacy tUVp i uszczelek) formy. Należy pamiętać o około 5mm grubości warstwy żelu.

1.10    Wylany żel pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 - 40 minut w celu uzyskania całkowitej jego polimeryzacji.

1.11    Nie wyjmując grzebienia formującego studzienki w żelu, zalać żel przygotowanym buforem lx elektroforetycznym do poziomu 2-3 mm ponad jego górną krawędź. Wysokość poziomu zależy od przyłożonego napięcia elektrycznego podczas prowadzenia elektroforezy. W celu uniknięcia efektów cieplnych oraz zmiany pH buforu, należy stosować większe objętości buforu elektroforetycznego podczas stosowania wyższych napięć.

1.12    Z żelu agarozowego ostrożnie wyjąć grzebień. Należy uważać, aby podczas usuwania grzebienia nie zniszczyć uformowanych studzienek oraz aby nie wprowadzić do studzienek pęcherzyków powietrza.

3.2.5 Elektroforeza DNA w żelach agarozowych

1.1    Wymieszać każdą z próbek DNA (patrz pkt. 2.4.3.3, 1.7) poddawanych elektroforezie z buforem obciążającym (tabela 10.8) w stosunku 5:1 (lub 1:1) i ostrożnie nanieść uzyskaną mieszaninę do studzienek przy pomocy pipety automatycznej. Maksymalna pojemność powstałych studzienek jest zależna od zastosowanego podczas wylewania żelu rodzaju grzebienia oraz od grubości żelu.

1.2    Zgodnie z kolorami elektrod umieścić ostrożnie pokrywę na aparacie do elektroforezy tak, aby nie naruszyć próbek w studzienkach. Aparat elektroforetyczny umożliwia założenie pokrywy tylko w jednym jej położeniu. Podłączyć aparat do zasilacza PowerPack 300.

Tabela 10.8

skład chemiczny buforu obciążającego	temperatura przechowywania
bufor TBE 6x stężony zawierający 0,25% błękitu bromofenolowego, 0,25% cyjanianu ksylenu (xylene cyanol FF) i 30% gliceryny*	4°C
* w buforze można pominąć xylene cyanol FF; glicerynę można zastąpić 40% sacharozą lub 15% fikolem

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia