3110399264

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych.

pozwala na wydzielenie frakcji RNA. DNA jest uzyskiwane na drodze następczej ekstrakcji gorącym (70 °C) 0,5 M kwasem nadchlorowym. Metodykę opracowaną przez Ogura i Rosena stosuje się także w przypadku otrzymywania kwasów nukleinowych z niektórych tkanek zwierzęcych oraz komórek mikroorganizmów np. do ekstrakcji RNA z komórek drożdży. Omawiana metoda nie jest jednak jednakowo wydajna w odniesieniu do wydzielania DNA z komórek różnych typów. W przypadku komórek drożdży, podczas frakcjonowania rybonukleotydów z homogenatu ekstrahowana jest także znacząca część DNA. Dane literaturowe wskazują, że izolując DNA z materiału bakteryjnego należy znacznie (do 30 godzin, czyli około dwukrotnie) wydłużyć czas ekstrakcji RNA schłodzonym roztworem kwasu nadchlorowego.

Tabela 10.3. Wydzielanie kwasów nukleinowych metodą Ogura i Rosena [1].

frakcja	postępowanie	związki fosforowe występujące w otrzymanej frakcji
materiał wyjściowy (tkanka)	homogenizacja tkanki świeżej lub przechowywanej w 70 - 90 % etanolu w 0 °C
FI	ekstrakcja homogenatu 70 % etanolem w 4 °C i następcze przemycie homogenatu 70 % etanolem zawierającym 0,1 % HCI0₄ w 4 °C	związki rozpuszczalne w etanolu
F2	2-krotna ekstrakcja homogenatu mieszaniną etanoketer = 3:1	fosfolipidy
F3	2-krotna ekstrakcja homogenatu 0,2 M HCI0₄ w 4 °C	związki rozpuszczalne w kwasach
F4	ekstrakcja homogenatu 1 M HCI0₄ w 4°C przez 18 h i 2-krotne przemycie uzyskanego osadu 1M HCI0₄(supernatanty można połączyć)	supernatant: rybonukleoidy osad: DNA, proteiny (białka komórkowe, fosfoproteiny)
F5	2-krotna ekstrakcja osadu 0,5 M HCI0₄w temp. 70 °C przez 20 min.	supernatant: DNA osad: fosfoproteiny

W odróżnieniu od przedstawionych powyżej metod izolacji DNA, metodyka zaproponowana przez Marmura (1961 r.) pozwala na wydzielenie frakcji DNA w postaci strukturalnie natywnych łańcuchów. Ta technika, opracowana na potrzeby izolacji cząsteczek kwasu deoksyrybonukleinowego z komórek mikroorganizmów, wykorzystuje zjawisko występowania DNA w jądrze komórkowym nie w postaci wolnej, lecz w formie deoksynukleoproteidu (DNP) będącego kompleksem dwuniciowych łańcuchów DNA z cząsteczkami histonów. Jest to efekt oddziaływania ujemnie naładowanych łańcuchów DNA (co jest skutkiem obecności reszt fosforanowych) z obdarzonymi dodatnim ładunkiem cząsteczkami białkowymi histonów posiadających w swojej strukturze dodatnio naładowane reszty aminokwasowe argininy oraz lizyny. Izolację DNA metodą Marmura można umownie podzielić na trzy etapy. W pierwszym z nich, po uprzedniej homogenizacji materiału biologicznego ekstrahuje się z niego RNP, RNA oraz składniki cytosolu, czego efektem końcowym jest otrzymanie osadu zawierającego m.in. frakcję DNP. W etapie drugim rozdysocjowuje się kompleks DNA i histonów, denaturuje białka a następnie w wyniku odwirowania utworzonego białkowego osadu otrzymuje się wodną frakcję DNA. Ostatnim, trzecim etapem jest wytrącenie dwuniciowych łańcuchów DNA z roztworu wodnego będące skutkiem dodania do wodnego roztworu schłodzonego alkoholu (np. etanolu lub 2-propanolu) wykazującego silne właściwości higroskopijne. Szczegółowy opis izolacji DNA ze zwierzęcego materiału biologicznego metodą Marmura przedstawiony został w punkcie 2.4.1.

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia