3110399254

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 11

Grasica jest gruczołem, w którym DNA występuje w dużym stężeniu przekraczającym 2 % suchej masy tkanki. Fakt ten ułatwia przeprowadzenie preparatywnej izolacji DNA. Do wydzielenia DNA z grasicy można użyć tkanki świeżej (pobranej bezpośrednio po uboju i następnie przechowywanej w lodzie) lub krótkotrwale zamrożonej w temperaturze -20 °C. Przeznaczoną do preparatyki DNA grasicę homogenizuje się i stabilizuje zobojętnionym (pH 7,0) roztworem cytrynianu sodu zawierającym chlorek sodu (roztwór SSC; ang. salinę sodium citrate), co poprzez kompleksowanie dwuwartościowych kationów metali (Mg²*, Mn²* oraz Co²*) prowadzi do inhibicji deoksyrybonukleaz katalizujących hydrolityczny rozkład łańcucha DNA. Następnie otrzymany z homogenatu przez odwirowanie DNP poddaje się działaniu soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jako anionowy detergent ułatwia rozdział. Do mieszaniny zawierającej m.in. DNA i proteiny dodaje się mieszaninę Sevag (chloroform:pentanol = 24:1) w celu przeprowadzenia denaturacji i wytrącenia białek, co w końcowym efekcie pozwala na uzyskanie oczyszczonego preparatu DNA w postaci supernatantu. Ostatecznie DNA wytrąca się z roztworu wodnego po dodaniu schłodzonego 2-propanolu, co może zostać dodatkowo zwizualizowane przez nawinięcie dwuniciowych łańcuchów DNA na szklaną bagietkę. Wyizolowany DNA powinien być bezbarwny, tzn. pozbawiony zanieczyszczeń proteinowych, w tym także histonów.

Odczynniki:

1.    zamrożona grasica cielęca - około 7 -10 g na każdą grupę ćwiczeniową;

2.    roztwór SSC - 0,15 M NaCI w 1,50 • 10‘³ M cytrynianu sodowego o pH 7,0 (roztwór cytrynianu można zastąpić 1,50 • 10'³ M EDTA);

3.    0,15 M cytrynian sodowy o pH 7,0;

4.    20% SDS;

5.    4g NaCI (naważki);

6.    mieszanina Savag - chlorofornrpentanol = 24:1;

7.    2-propanol (bezwodny).

Sprzęt laboratoryjny:

1.    łaźnia wodna (55 °C);

2.    wirówka laboratoryjna (3 500 rpm);

3.    zlewka 250 mL -1 szt.;

4.    zlewka 100 mL -1 szt.;

5.    probówka typu Falcon® 50 mL -1 szt.;

6.    pipeta 25 mL -1 szt.;

7.    cylinder 100 mL-1 szt.;

8.    bagietka szklana.

Procedura wykonania:

1.    Porcję (świeżej lub zamrożonej) grasicy cielęcej homogenizować 2 min. w 25 mL schłodzonego (4 °C) roztworu SSC. Na skutek homogenizacji zniszczone zostają ściany komórek tworzących preparat, co prowadzi do uwolnienia z nich jąder komórkowych, DNP oraz RNP. Podczas homogenizacji w zastosowanym roztworze NaCI z dodatkiem cytrynianu rozpuszczeniu ulega RNP natomiast DNP pozostaje nierozpuszczony.

2.    Otrzymany homogenat przenieść do 50 mL probówki typu Falcon® i następnie odwirować (3 500 rpm, 15 min.).

3.    Supernatant zawierający rozpuszczony rybonukleoproteid (RNP) wylać.

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia