3110399255

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych. 12

4.    Odwirowany osad zawierający DNP zawiesić w 20 mL 0,15 M cytrynianu sodowego i następnie dodać 4 mL 20 % SDS i dokładnie wymieszać zawartość probówki.

5.    Zawartość probówki inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C ciągle mieszając.

6.    Po 15 min. inkubacji dodać do probówki 4 g NaCI celem zwiększenia siły jonowej roztworu i umożliwienia rozpuszczenia się DNA, po czym ponownie inkubować zawartość probówki w 55 °C ciągle mieszając przez następne 10 min., aż do zaobserwowania całkowitego rozpuszczenia się DNP.

7.    Do probówki dodać 25 mL mieszaniny Savag i intensywnie wstrząsać przez 10 min., pamiętając o okresowym wypuszczaniu gromadzących się w probówce gazów.

8.    Zawartość probówki odwirować (3 500 rpm, 20 min.).

9.    W wyniku odwirowania, w probówce otrzymuje się roztwór trójfazowy: górna faza stanowiąca fazę wodną zawierającą DNA; środkowa faza zawierająca resztki protein zdenaturowanych roztworem detergentu; dolna faza stanowiąca fazę organiczną niezawierającą DNA.

10.    Fazę wodną (górną) przenieść ilościowo do suchej zlewki 100 mL.

11.    Do zlewki zawierającej frakcję DNA dodawać porcjami uprzednio schłodzony (4 °C) bezwodny 2-propanol jednocześnie mieszając otrzymany roztwór szklaną bagietką aż do nawinięcia wytrąconego, odwodnionego DNA.

12.    Uzyskany preparat DNA stanowi materiał wyjściowy do badania właściwości biochemicznych kwasu nukleinowego oraz po przeprowadzeniu kwasowej lub zasadowej hydrolizy preparat do oznaczania składników elementarnych kwasów nukleinowych (zasad azotowych, pentoz, orto-fosforanu).

3.2 Izolowanie ultraczystego, plazmidowego DNA

Do izolowania ultraczystego, plazmidowego DNA z hodowli bakteryjnej został użyty zestaw Plazmid Miniprep Plus firmy Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.

Zasada stosowanej w ćwiczeniu metody izolowania plazmidowego DNA oparta jest na klasycznej lizie alkalicznej (I etap) i zdolności wiązania DNA przez złoża krzemionkowe w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych (II etap). Elektrostatyczna neutralizacja ładunków białek i kwasów nukleinowych przez niskie stężenia soli zwykle stabilizuje ich strukturę. Jednakże wysokie stężenie soli (>1M) działa destabilizująco. Na zmianę struktury białek i DNA mają większy wpływ aniony niż kationy, które tworzą tzw. szereg chaotropowy:

F < SO„^!' < Cl' < Br < CIO, < SCN' < CIjCCOO'.

Efekt chaotropowy nasila się począwszy od jonów fluorkowych. Sole destabilizujące, silnie wiążąc cząsteczki wody, obniżają hydratację cząsteczek a w końcowej fazie, nie niszcząc struktury, prowadzą do tworzenia się agregatów i wypadania białek czy DNA z roztworu (wysalanie). Do wywołania efektu chaotropowego najczęściej wykorzystuje się mocznik, chlorowodorek guanidyny, siarczan amonu.

Pierwszy etap wykonywanych czynności obejmuje klasyczna liżę alkaliczną komórek bakterii. Następuje precypitacja chromosomalnego DNA, białek i większości wprowadzonego wcześniej detergentu. Po zobojętnieniu lizatu renaturuje, przechodząc do roztworu, tylko relatywnie mały plazmidowy DNA, RNA oraz nieznaczna część białek. Zdenaturowane wielkocząsteczkowe związki usuwamy poprzez odwirowanie próbki. Po etapie lizy alkalicznej proces uzyskania czystego plazmidowego DNA można przeprowadzić na wiele sposobów. Klasyczna metoda polega na ekstrakcji lizatu fenolem lub mieszaniną fenol-chloroform. Fenol denaturuje białka, które tworzą osad na

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia