numero tres

Izolacja genomowego DNA z pełnej krwi

1.    Pobrać 1 ml krwi obwodowej na EDTA, dodać 500 |lł1 PBS

2.    Wirować 2500 rpm 15 min 4°C, odrzucić supernatant

3.    Dodać 1 ml buforu do lizy (155 mM NH₄C1, 10 mM KHC0₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,4), mieszać, Inkubować 30 min.0°C

4.    Wirować 2500 rpm 15 min 4°C, odrzucić supernatant

5.    Osad zawiesić w 100 pl buforu do lizy, dokładnie wymieszać

6.    Dodać 500 pl GTC (4 M izotiocyjanian guanidyny, 34 mM cytrynian sodu, 0,5% sarkosyl oraz 0,78% 2-merkaptoetanol - dodajemy tuż przed użyciem, pH 7) dokładnie wy mieszać -pipetować, inkubować 15 min 0°C

7.    Dodać 600 pl mieszaniny fenol:chloroform:alk izoamylowy (25:24:1) dokładnie wymieszać

8.    Wirować 12000 rpm 5 min 4°C, zebrać supernatant

9.    Dodać 600 pl chloroformu dokładnie wymiieszać

10.    Wirować 12000 rpm 5 min 4°C, zebrać supernatant

11.    Dodać 1 ml zimnego (-20°C) EtOH (lub 1 ml izopropanolu), inkubować 15 min w -20°C

12.    Wirować 12000 rpm 5 min 4°C usunąć ostrożnie supernatant

13.    Przemyć osad 500 pl 70% etanolu (gdy był używany izopropanol), wysuszyć osad

14.    Rozpuścić DNA w- 20 pl sterylnej wody bądź buforu TE