00

zastosowania do genomowego DNA, nadaje się do oczyszczania plazmidów i kos-midów. Jedną z głównych jej zalet jest krótki czas wykonania.

Materiał: Krew.

Odczynniki:

1)    Bufor do Iizy erytrocytów: 140 mM NH₄C1 - 100 mM Tris/HCl (pH 7,6).

2)    0,85% roztwór NaCl.

3)    Bufor HTE o pH 8,0: 100 mM Tris/HCl - 40 mM Na₂EDTA.

4)    0,2% roztwór SDS w buforze HTE (odcz. 3).

5)    6 M roztwór izotiocyjanianu guanidyny.

6)    Mieszanina: fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1).

7)    Alkohol izobutylowy.

8)    70% roztwór etanolu.

9)    Bufor TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA.

Wykonanie:

1.    Krew zmieszać z 5 objętościami buforu do lizy erytrocytów (odcz. 1), ogrzanego do temp. 37°C oraz inkubować w tej temperaturze przez 5 min.

2.    Odwirować (1000 xg w temp. 25°C przez 10 min) i ostrożnie usunąć supernatant.

3.    Osad leukocytów zawiesić w 10 ml odczynnika 2.

4.    Powtarzać etapy 2. i 3. aż do uzyskania zadowalająco niskiego poziomu zanieczyszczenia erytrocytami.

5.    Po ostatnim wirowaniu zawiesić osad leukocytów w buforze HTE (odcz. 3). Przeprowadzić liżę leukocytów dokonując szybkiej iniekcji (strzykawką z igłą nr 18) 2 ml roztworu SDS (odcz. 3) do zawiesiny leukocytów. Do zlizowanych komórek dodać 1,5 objętości roztworu izotiocyjanianu guanidyny (odcz. 5) i mieszać przez odwracanie probówki.

6.    Przeprowadzić ekstrakcję białek komórkowych za pomocą równej objętości mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 6).

7.    Powtarzać ekstrakcję aż do zaniku interfazy.

8.    Do fazy wodnej zachowanej po ostatniej ekstrakcji dodać równą objętość alkoholu izobutylowego (odcz. 7), aby wytrącić DNA. Odzyskać wielkocząsteczkowy DNA używając pipety ze ściętym końcem. Płukać DNA w 70% roztworze etanolu bez wirowania.

9.    Rozpuszczać DNA w buforze TE (odcz. 9) w temp. 4°C co najmniej 24 godz. Uwagi:

1)    Cząsteczki DNA w roztworze izotiocyjanianu guanidyny są stabilne i mogą być w nim przechowywane przez co najmniej 2 miesiące.

2)    Do zaniku interfazy w czasie ekstrakcji fenolem zazwyczaj wystarczą 2-3 zabiegi.

3)    Wydajność tej metody przekracza niemal 2-krotnie wydajność tradycyjnej metody fenolowej (ćw. 10.1).

Ćwiczenie 10.10. Izolowanie niskocząsteczkowego DNA (R. Rossi, M.P. Viola-Ma-gni 1978: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 158:117-122)

Zasada: Enzymatyczne trawienie jąder komórkowych może prowadzić do sytuacji, w której w chromatynie będą występować powtarzające się krótkie fragmenty DNA

380