0 4

Hybrydyzacji z sondami molekularnymi można poddawać całkowity genomowi DNA lub całkowity komórkowy RN A. Możliwe są liczne rozwiązania metodyczna Tak więc analizowane kwasy nukleinowe (po denaturacji) można unieruchamiać na nylonowych lub nitrocelulozowych błonach w formie plam (dot blotting), a nastęjy nie prowadzić hybrydyzację w roztworze zawierającym określoną sondę. Detekcja pozytywnego sygnału, świadcząca wtedy o rozpoznaniu przez sondę komplementai-nej sekwencji nukleotydowej, dowodzi istnienia w' badanym materiale poszukiwanego DNA lub RNA. W tym typie hybrydyzacji możliwa jest sytuacja odwrotna, kiedy to sonda jest unieruchomiona na trwałym podłożu, a badany materiał dodawany jest w roztworze hybrydyzacyjnym. Hybrydyzacja typu dot blotting okazała się techniką bardzo szybką i wygodną. Ma jednak z wielu względów' ograniczone zastosow-anie w przypadkach analiz całkowitego genomowego DNA, gdzie jej czułość może być niewystarczająca. Bywa natomiast przydatna do wykrywania w danym materiale obcych gatunkowo kwasów nukleinowych (analiza patogenów bakteryjnych lub wirusowych), a także w badaniach krótszych i namnożonych produktów określonych reakcji PCR. Można ją także stosować w precyzyjnym genotypowymi u polimorficznych alleli lub do w-ykrywania mutacji punktowych w danych genach, ale wtedy potrzebne są bardzo specyficzne sondy i ścisłe przestrzeganie warunków hybrydyzacji.

Inną metodę hybrydyzacji, pozwalającą bardziej precyzyjnie identyfikować określony fragment DNA, opracował w 1975 r. Southern. Łączyła ona trawienie genomow^rcgo DNA przez wybrane nuklcazy restrykcyjne (podrozdz. 10.3.2), rozdział elektroforetyczny otrzymanych fragmentów w^f żelu agarozowym i przeniesienie ich z żelu, po denaturacji, na błonę nitrocelulozową (Southern blotting) z klasyczną procedurą hybrydyzacyjną (rys. 10.16).

Proces elektroforezy zapewnia „rozciągnięcie" genomowego DNA według długości fragmentów wytworzonych pod działaniem restryktaz, a tym samym w' stały sposób porządkuje w żelu analizowany materiał. Transfer DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy odbywa się w tej metodzie za pomocą wykorzystania sił włosowato-ści do wymuszenia wędrówki fragmentów łańcuchów polinukleotydowwch. W późniejszych modyfikacjach zastosowano błony nylonowa, a przenoszenia materiału z żelu dokonywano za pomocą aparatów podciśnieniowych. Bardzo często wykonując analizy hybrydyzacyjnc metodą Southerna pomija się etap przenoszenia rozdzielonych w' żelu agarozow^fym fragmentów' restrykcyjnych DNA na stosowne błony czy filtry. Okazało się bowńem, że proces hybrydyzacji można przeprowadzić na samym żelu, susząc go w' taki sposób, aby stał się rówmie cienki i elastyczny, jak używane membrany. Jeśli zastosuje się silnie wyznakowane radioizotopami sondy molekularne, to czułość omawianej techniki jest bardzo duża (~0,1 pg DNA}. Z drugiej strony można także, manipulując warunkami hybrydyzacji, uzyskiwać sygnał z cząsteczek, których sekwencje w'ykazują jedynie 55-60% homologii do sekwencji użytej sondy (jest to w'ażne np. w' badaniach międzygatunkowych).

Hybrydyzacja metodą Southerna umożliwia ponadto badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA — RFLP (restriction fragment length polymorphism). Polimorfizm ten może mieć charakter naturalny, ponadto jego

454