Metody izolacji i oczyszczania DNA (2)

manie około 50 ng DNA z kropli krwi o średnicy 3 mm, gwarantując jednocześnie dużą czystość otrzymanego lizatu. Metody ekstrakcji DNA na złożach tego typu obejmują wszystkie ogólne etapy ekstrakcji DNA (rozdrobnienie tkanki, liza, enzymatyczne usuwanie białek i wytrącanie), ale są one przeprowadzane w jednej kolumnie ekstrakcyjnej, a ze względu na skuteczność wiązania przez membranę są również dwu-, trzykrotnie krótsze niż metody tradycyjne. Jedyną wadą izolacji DNA na kolumnach jest wysoka cena zestawów, tzw. kitów, i niemożność przygotowywania buforów we własnym zakresie.

2.4.    Oznaczanie stężenia roztworu DNA

Najdokładniejszy pomiar stężenia wyekstrahowanego DNA w roztworze można otrzymać przy użyciu spektrofotometru. Oznaczanie stężenia roztworu DNA za pomocą spektrofotometru opiera się na pomiarze absorpcji światła przy długości fali równej najpierw 260 nm, a następnie 280 nm. Zmierzona w ten sposób gęstość optyczna (OD) pozwala zarówno wyznaczyć stężenie kwasu nukleinowego, jak i oszacować jego czystość. Oznaczona wartość OD₁₆₀ stanowi wykładnik stężenia DNA (lub RNA), ponieważ roztwór DNA, wykazujący absorpcję przy 260 nm równą 1,0, odpowiada roztworowi DNA dwuniciowego o stężeniu 50pg-ml^-1. Stosunek OD₂₆₀/OD_2g0 (Ratio) opisuje czystość uzyskanego preparatu i dla czystych roztworów (wolnych od białek czy fenolu) wynosi 1,8-2,0. Wartość mniejsza niż 1,8 wskazuje na pozostałości fenolu, wartość większa niż 2,0 - na zanieczyszczenia RNA lub inne. Mniej dokładnym, ale często stosowanym sposobem na zgrubne oznaczenie ilości DNA jest elektroforeza izolatu w żelu agarozowym w obecności bromku ety dyny razem ze standardem o znanej masie, na przykład fagiem lambda.

2.5.    Oczyszczanie DNA po ekstrakcji

Pomiar stężenia DNA po rutynowej ekstrakcji może wykazać obecność zanieczyszczeń. Na ogół są to zanieczyszczenia organiczne, które zostały przefiltrowane na przykład przez rozszczelnione mechanicznie złoża lub nie zostały strawione przez proteinazę. W takim przypadku konieczne jest ponowne oczyszczenie roztworu. Rutynowo wykonuje się je na złożach selektywnych, które mają jednocześnie za zadanie doczyścić próbkę i ją zagęścić. Należy pamiętać, że po ponownym oczyszczeniu roztworu DNA wydajność izolacji spadnie.

2.6.    Procedury laboratoryjne

2.6.1. Izolacja DNA z krwi ssaków metodą fenolowo-chloroformową

1.    Przygotować 4 probówki typu eppendorf o pojemności 2 ml. Wszystkie należy opisać na wieczku i z boku numerem próbki.

2.    Do probówki dodać 1 ml rozmrożonej krwi oraz 1 ml buforu lizującego. Mieszać przez odwrócenie.

3.    Wirować w temperaturze pokojowej 1 minutę z prędkością, 12 tys. obr-min^-1. Wylać płyn znad osadu.

4.    Do osadu dodać 1 ml buforu lizującego i końcówką pipety rozbić osad.

5.    Wirować w temperaturze pokojowej 1 minutę z prędkością, 12 tys. obr-min^-1. Wylać płyn znad osadu.

6.    Kroki 4 i 5 należy powtórzyć aż do uzyskania kremowej barwy osadu. Po ostatnim zlaniu buforu lizującego należy odwirować próbkę jeszcze przez 30 sekund z prędkością 12 tys. obr min^-1 i dokładnie (końcówką pipety) odciągnąć resztę buforu.