Metody izolacji i oczyszczania DNA

DNA

oczyszczania

2.1. Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Umiejętność izolowania DNA jest jedną z podstawowych czynności w laboratorium. Ekstrakcja DNA z komórek organizmów eukariotycznych pozwala na otrzymanie w jednej probówce kwasu nukleinowego jednocześnie z jądra komórki i z cytoplazmy (mitochondriów, plastydów), tzw. całkowitego DNA.

Głównym czynnikiem determinującym otrzymanie dobrej jakości DNA jest rodzaj tkanki, sposób jej pobrania i przechowywania. Każdy rodzaj tkanki jako materiał biologiczny, będący potencjalnym źródłem zakażenia, należy pobierać w rękawiczkach! Pobierając materiał biologiczny jałowo, chronimy go również przed zanieczyszczeniem ze strony pobierającego. W niektórych przypadkach (w pracy z materiałem łatwo ulegającym zanieczyszczeniu, np. śliną) może dojść do zanieczyszczenia go ludzkimi komórkami nabłonka, dlatego wszystkie tkanki powinny być pobierane jałowo i do czasu ekstrakcji DNA przechowywane w odpowiednich warunkach. Ze względu na stopień inwazyjności pobierania tkanki poszczególne ich typy można sklasyfikować jako pobierane przyżyciowo i post mortem. Klasyfikację tkanek i sposób ich kolekcjonowania opisuje tabela 1. Pobrane tkanki powinny być rozdzielone na porcje bądź na fragmenty nadające się do jednorazowej ekstrakcji DNA. Tkanek nie należy zbyt często odmrażać (jeśli wymagają mrożenia) i wystawiać na działanie czynników zewnętrznych, ponieważ każdfcdkanka przechowywana pozaustrojowo ulega silnej degradacji.

Tabela 1. Klasyfikacja i kolekcjonowanie tkanek do ekstrakcji całkowitego DNA

Rodzaj tkanki	Sposób pozyskiwania	Sposób przechowywania
Krew obwodowa	przyżyciowo	probówka próżniowa z antykoagulantem (sól sodowa lub potasowa kwasu wersenowego - EDTA); mrożenie w temp. -70°C
Komórki nabłonka (ślina)	przyżyciowo	jałowa wala (wymazówka); temp. +4"C lub bibuła nasączona konserwantem (karty FTA); miejsce suche w temp. 18-25°C
Komórki nabłonka (mocz)	przyżyciowo	jałowa wata (wymazówka); temp. +4°C lub bibuła nasączona konserwantem (karty FTA); miejsce suche w temp. 18-25°C
Komórki nabłonka (kał)	przyżyciowo	jałowy pojemniczek z roztworem soli fizjologicznej (lub buforu lizującego z dodatkiem SDS); temp. +4°C
Komórki naskórka, twory skórne	przyżyciowo	jałowy pojemniczek z roztworem etanolu (40-70%); temp. od -20"C do +25"C lub szczelny woreczek foliowy typu zip lock z substancją odprowadzającą wilgoć (Blue silica gel); miejsce suche w temp. 18-25°C
Włosy z cebulkami	przyżyciowo	Papierowa torebka (koperta); miejsce suche w temp. 18—25°C
Sperma	przyżyciowo	jałowa wata (wymazówka); temp +4°C lub bibuła nasączona konserwantem (karty FTA); miejsce suche w temp. 18-25°C
Tkanki miękkie (wątroba, nerka, serce)	post mortem	szczelny woreczek foliowy typu zip lock; mrożenie w temp. -20°C
Tkanki twarde (substancja gąbczasta, kości, szpik, chrząstki)	post mortem	szczelny woreczek foliowy typu zip lock; mrożenie w temp. -70°C