0
3

5.    Odwirować (13 000x0 w temp. pokojowej przez 30 min), usunąć supernatant. Dodać 700 pl etanolu i łagodnie mieszać przez powolne obracanie probówki.

6.    Odwirować (13 000x0 w temp. pokojowej przez 30 s), usunąć supernatant, a następnie dotknąć krawędzi probówki bibułą, aby przez działanie kapilarne usunąć jak najwięcej cieczy.

7.    Suszyć osad DNA w temperaturze pokojowej przez 5-10 min i rozpuszczać w 100 pl buforu TE (odcz. 9), najlepiej w temp. 4°C przez dobę.

Uwagi:

1)    DNA otrzymany tą metodą można zastosować w podstawowych badaniach z zakresu biologii molekularnej.

2)    Stosunek A₂₆₀//ł₂₈₀, który jest miarą czystości DNA, powinien wynosić 1,8-2,0.

Ćwiczenie 10.4. Izolowanie DNA uproszczoną metodą odsalania białek (R. Słomski 1997: Analiza struktury genów. Wyd. Akademii Rolniczej w Poznaniu, s. 47)

Zasada: Podstawą tej metody jest proces odbiałczania, wykorzystywany w ćw. 10.3, jednakże w obecnym postępowaniu nie stosuje się chloroformu, co pozwala unik-niąć silnie toksycznych substancji w wielu procedurach biologii molekularnej.

Materiał: Krew.

Odczynniki:

1)    1% roztwór EDTA jako antykoagulant.

2)    Bufor do lizy: 155 mM NH₄C1 - 10 mM KHCO, - 0,1 mM Tris/HCl (pH 7,4).

3)    Bufor SE (ang. sodium chloride - Na₂EDTA): 75 mM NaCl - 1 mM Na₂EDTA (pH 8,0).

4)    Roztwór proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml.

5)    20% roztwór SDS.

6)    6 M roztwór NaCl.

7)    Absolutny etanol.

8)    70% roztwór etanol.

Aparatura: Wirówka, np. Sorvall RT 6000B.

Wykonanie:

1.    10 ml krwi obwodowej pobrać na antykoagulant (odcz. 1) i dodać 30 ml buforu do lizy (odcz. 2).

2.    Inkubować w temp. 0°C przez 30 min, kilkakrotnie mieszając.

3.    Odwirować (2000 x g w temp. 4°C przez 10 min).

4.    Osad leukocytów zawiesić ponownie w buforze do lizy (odcz. 2) i odwirować jak w etapie 3. Czynność tę powtórzyć 3-krotnie.

5.    Do osadu otrzymanego po ostatnim wirowaniu dodać 5 ml buforu SE (odcz. 3), 25 ąl proteinazy K (odcz. 4) i 250 pl SDS (odcz. 5). Dokładnie wymieszać.

6.    Inkubować (w temp. 55°C przez 16 godz.), a otrzymany lizat ekstrahować nasyconym roztworem NaCl (odcz. 6) ok. 15 s, intensywnie mieszając.

7.    Odwirować (2000x0 w temp. pokojowej przez 15 min).

8.    Wytrącić DNA 2 objętościami etanolu (odcz. 7) i przemyć 70% roztworem etanolu, za każdym razem wirując jak w etapie poprzednim. Rozpuszczać DNA w wodzie przez 24 godz.

Uwaga: DNA otrzymany tą metodą nadaje się do zastosowania w najważniejszych badaniach z zakresu biologii molekularnej.

373