07

wybarwianie obu kwasów nukleinowych z zastosowaniem jednego tylko fluorochromu. Przykładem jest tu bromek etydyny, stosowany do wykrywania cząsteczek DNA i RNA rozdzielonych elektroforetycznie w żelach agarozowych i poliakrylamidowych oraz oranż akrydynowy — popularny barwnik w oznaczeniach cytofluorymetrycznych.

Ćwiczenie 10.21. Badanie oddziaływania barwników fluorescencyjnych (na przykładzie oranżu akrydynowego) z DNA i RNA (J. Kapuściński i wsp. 1987: J. Biomol. Struct. Dyn., 5:127-143)

Zasada: Oranż akrydynowy po wzbudzeniu promieniowaniem o długości fali 350 nm daje zieloną fluorescencję (ź = 530 nm), gdy oddziałuje z dwułańcuchowym DNA, a czerwoną luminescencję (A = 650 nm), gdy występuje w kompleksie z RNA lub zdenaturowanym DNA. Ta właściwość oranżu akrydynowego pozwoliła zaobserwować interesujące zjawisko, że nadmiar związków interkalujących do DNA powoduje jego denaturację. Ten proces jest zapewne odpowiedzialny za cytostatyczne działanie związków interkalujących, stosowanych jako leki przeciwnowotworowe lub antybiotyki (np. mitoksantron i adriamycyna).

Materiał i odczynniki:    p

1)    DNA z grasicy bydlęcej (cieląt) i RNA z drożdży o stężeniu 5 ąg/ml w roztworze: 100 mM NaCl -- 1 mM EDTA - 5 mM bufor HEPES (pH 7,0).

2)    Oranż akrydynowy o stężeniu 1 mM w roztworze: 1 mM EDTA - 10 mM bufor fosforanowy (pH 7,0) - 25% etanol. Stężenie oranżu ustalić kolorymetrycznie, przyjmując jako molowy współczynnik absorpcji przy ż₄₇₄ wartość 4,76 • 10⁴.

Wykonanie:

1.    Wyznaczanie widm luminescencyjnych. Do kuwety kwarcowej dodać 2 ml roztworu kwasu nukleinowego oraz 20 pi roztworu oranżu akrydynowego. Po dokładnym wymieszaniu wyznaczyć we fluorymetrze widmo luminescencyjne w zakresie 500-700 nm, stosując promieniowanie wzbudzające o długości fali 350 nm. Porównać widma dla DNA i RNA. Powtórzyć doświadczenie ze zdenaturowanymi preparatami kwasów nukleinowych. Denaturację termiczną prowadzić w temp. 95°C przez 5 min, a następnie próbki oziębić w łaźni lodowej; przed pomiarem fluorescen-cji doprowadzić je do temperatury pokojowej.

2.    Badanie denaturacji DNA przez nadmiar barwnika fluorescencyjnego. Do jednej kuwety kwarcowej dodać 2 ml roztworu DNA, a do drugiej — 2 ml roztworu do rozpuszczania kwasów nukleinowych. Do obu kuwet wprowadzić stopniowo, w 5 porcjach, wyjściowy roztwór oranżu akrydynowego, aby jego ilość zwiększała się od 20 do 200 pl. Po dodaniu każdej porcji barwnika w obu kuwetach zmierzyć fluorymetrycznie luminescencję przy długości fali emisyjnej 530 nm (wzbudzenie A = 350 nm). Wykonać wykres zależności luminescencji względnej /_s//_b (gdzie: /_s — luminescencja kompleksu DNA-oranż akrydynowy, /_b — luminescencja samego barwnika) od stężenia oranżu akrydynowego w próbie (rys. 10.3 i 10.4). Jeżeli wartość luminescencji typowej dla kompleksu oranżu akrydynowego z dwułańcuchowym DNA maleje wraz ze wzrostem stężenia barwnika, to świadczy o postępującym procesie denaturacji DNA i tym samym wzroście długości fali emisyjnej.

397