03

10.2.2. Spektrofotometria kwasów nukleinowych

Spektrofotometria absorpcyjna. Wybiórcze pochłanianie światła o różnej długości fali przez substancje znalazło zastosowanie w analizie chemicznej. Szczególnie szeroko wykorzystuje się pomiary pochłaniania w zakresie światła widzialnego (400-750 nm), bliskiego nadfioletu (200-400 nm) i bliskiej podczerwieni (750-2500 nm). Przyczyną pochłaniania promieniowania w nadfiolecie (UV) i w zakresie światła widzialnego są zmiany poziomów energetycznych elektronów tworzących wiązania chemiczne między atomami w cząsteczce. Wiązania pojedyncze pochłaniają promieniowanie w zakresie dalekiego nadfioletu o dlugOŚćn&ITfźęćfif 100-200 nm. Wiązania podwójne absorbują promieniowanie w zakresie bliskiego nadfioletu rzędu 200-300 nm.

Decydujący wpływ na położenie pasma pochłaniania ma przechodzenie na wyższe poziomy energetyczne elektronów tworzących podwójne wiązania. Zależy to od budowy cząsteczki, a przede wszystkim od wzajemnego położenia wiązań podwójnych. W przypadku sprzężenia podwójnych wiązań pasmo pochłaniania jest przesunięte w kierunku fal dłuższych. Jeśli występuje kilka sprzężonych wiązań podwójnych, to położenie pasma pochłaniania może być przesunięte nawet do długich fal zakresu widzialnego (barwniki, np. karoten). Pochłanianie promieniowania przez substancje przedstawia się zwykle w postaci wykresów zależności absorbancji od długości fali (definicję absorbancji podano w podrozdz. 3.1). Spektrofotometria jest szeroko stosowana zarówno w analizie jakościowej (identyfikacja), jak i ilościowej związków. Pozwala analizować mikrogramowe ilości badanych związków.

Kwasy nukleinowe oraz produkty ich metabolizmu i trawienia (nukleotydy, nukleozydy, zasady azotowe) pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie fal o długości 250 -280 nm. Właściwość taką mają wszystkie związki zawierające układ purynowy lub pirymidynowy. W pierścieniach tych znajdują się bowiem wiązania podwójne, a także heteroatomy. Reszta fosforowa oraz cukrowa praktycznie nie wpływają na intensywność i charakter pochłaniania, stąd widma absorpcji zasad azotowych, nukleozydów i nukleotydów są bardzo podobne.

Tabela 10.1. Molowe współczynniki absorpcji (c) zasad azotowych i nukleotydów

Zasady azotowe 0,1 M roztworze HCI	Maksimum absorpcji (nm)	£	Nukleotydy w 0,01 M roztworze HCI	Maksimum absorpcji (nm)	£
Adenina	265,5	12600	AMP	260	13900
Guanina	249	11 100	GMP	260	11800
Uracyl	260	8150	UMP	262	9890
Tymina	265	7950	CMP	278	12 720
Cytozyna	276	10000	Kwas pseudo-	263	8400
5-Metylocytozyna	283	9790	urydylowy (*PNP)

Widma absorpcji w UV różnych związków purynowych i pirymidynowych różnią się w niewielkim stopniu położeniem maksimów, a wyraźnie intensywnością pochłaniania. Związki purynowe i pirymidynowe mają bowiem różne molowe współczynniki absorpcji (e) (tab. 10.1). Widma absorpcji głównych zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych (w 0,1 M HC1) przedstawiono na rys. 10.2.

Dla roztworów o innych stężeniach jonów wodorowych wygląd krzywych absorpcji jest inny. Widmo adeniny niewiele zmienia się zależnie od pH roztworu, widma guaniny i pirymidyn ulegają natomiast znacznym zmianom. Wszystkie te

393